Серологические реакции.
Применение серологических реакций (цель):
· Обнаружение в сыворотки крови больного а/т против возбудителя заболевания
· Идентификация м/о в биологическом материале при помощи иммунных сывороток (известных а/г)
· Идентификация а/г, биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых а/г, иммунных комплексов, рецепторов клеток…
Реакции антиген-антитело.
Реакции а/г-а/т – это процесс взаимодействия антитела со специфическим для него антигеном, протекает в две фазы – специфическая и неспецифическая.
· Специфическая фаза – это быстрое связывание Fab-фрагмента активного центра антитела с эптоком (детерминантой) специфического антигена.
· Неспецифическая фаза – это более медленная фаза, в которую происходят видимые физические явления – образование хлопьев (агглютинация), помутнение (образование преципитата). Для протекания этой фазы необходимы определенная pH, наличие электролитов
На принципе реакции антиген-антитело основаны следующие серологические реакции:
Реакция агглютинации (РА):
Простая реакция в которой происходит склеивание корпускулярных а/г под действием антител, что проявляется образованием осадка или хлопьев. Имеет разновидности.
1. В пробирках к разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микроорганизмов), через определенное время при t 37ºС появляется агглютинация, отмечают титр наибольшего разведения сыворотки.
2. Ориентировочная РА на предметном стекле для определения возбудителя в материале взятого от больного. К капле диагностической иммунной сыворотки в разведении 1:10-20 добавляют чистую культуру возбудителя выделенную от больного. При наличии агглютинации ставят развернутую реакцию с разведениями диагностической сыворотки.
Применение:
· для определения а/т в сыворотке крови больных (при бр.тифе – реакция Видаля, при бруцеллезе – реакции Райта, Хеддлсона…).
· для определения возбудителя в биологическом материале взятом от больного.
· для определения групп крови.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА):
Основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности а/г или а/т (эритроцитарный диагностикум), взаимодействие которых с соответствующими а/т или а/г в сыворотки крови больных вызывает выпадение эритроцитов на дно пробирки в виде фестончатого осадка (зонтик с неровными краями на дне пробирки).
Применение:
· для диагностики инфекционных болезней (определение а/т или а/г в сыворотку крови)
· определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности
· выявления повышенной чувствительности больного к ЛС и гормонам.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА):
Основана на взаимодействии вирусных гемагглютинирующих H-а/г со специфическими а/т, в результате чего происходит торможение агглютинирующей активности вируса.
К разведениям исследуемой сыворотки добавляют равный объем разведения вируса инкубируют 2 часа, затем добавляют куриные эритроциты и снова инкубируют. Оценку проводят по феномену торможения агглютинации. Положительная реакция РТГА характеризуется образованием плотного осадка эритроцитов на дне в виде диска.
Реакция коагглютинации:
Это р азновидностью реакции агглютинации, в которой а/г возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержат протеин-А, имеющий сродство к Ig, и неспецифически адсорбируют на себе а/г, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими м/о, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья (комплекс стафилококк-а/т-м/о).
Реакция преципитации (РП):
Преципитат это осадок комплекса а/г-а/т. Реакция преципитации – это осаждение комплекса а/г-а/т.
1. Реакция кольцепреципитации – ставят в пастеровских пробирках наслоением раствора а/г на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Избыток а/г не влияет на результат реакции. Если в качестве а/г в реакции используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, реакция носит название реакции кольцепреципитации по Асколи.
2. Реакция преципитации в геле – на плотную питательную среду в чашке Петри помещают полоску фильтровальной бумаги пропитанной диагностической антитоксической сывороткой к предполагаемому возбудителю и производя посев материала взятого от больного, в процессе роста колоний происходит диффузия токсинов в гель и на границе колонии и фильтровальной бумаги формируется преципитат в виде узкой беловатой линии.
Реакция нейтрализации (РН):
а/т иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие м/о и их токсинов на чувствительные клетки ткани. К фильтрату продукта послужившего отравлению (при ботулизме) добавляют поливалентную сыворотку, инкубируют 2 часа для протекания реакции и вводят внутрибрюшно лабораторно мыши, а контрольной мыши вводят только фильтрат. Если в фильтрате есть ботулотоксин, то контрольная мышь погибает с явлениями паралича (осиная талия), а подопытная мышь остается живое – явления нейтрализации токсина сывороткой.
Реакцию связывания комплемента (РСК):
Протекает в две фазы:
1-я фаза – в реакции участвуют а/г, а/т и комплимент, причем а/г или а/т могут быть взяты от больного или являться диагностическими (диагностикум или сыворотка). При соответствии а/т к а/т происходит связывание комплимента.
2-я фаза – индикаторная – определение в смеси наличия свободного комплемента добавлением гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка), если комплимент свободен, то происходит гемолиз эритроцитов барана (РСК отрицательная), а если комплимент связан то гемолиз не наступает (РСК положительная). Реакцию святят по инструкции (таблице).
Реакция Кумбса:
Применение – выявление неполных (одновалентных) а/т, которые при присоединении к а/г не дают видимых эффектов.
К исследуемой сыворотке добавляют а/г, происходит реакция а/г-а/т без видимого эффекта, затем добавляют антиглобулиновую сыворотку(АГС), ее а/т замыкают неполный комплекс а/г-а/т с 2-х сторон, затем к этим а/т присоединятся новые неполные комплексы и происходит выпадение хлопьев и осадка.
Реакция радиального гемолиза:
Ставят в геле агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки вокруг них в результате радиальной диффузии антител образуется зона гемолиза, размеры которой пропорциональны титру сыворотки. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля с данными эритроцитами добавляют сыворотку крови больного.
Реакция иммунного прилипания:
Основана на активации системы комплемента корпускулярными а/г, обработанными иммунной сывороткой. В результате образуется активированный компонент комплемента С3а, который присоединяется к корпускулярному а/г в составе иммунного комплекса. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для С3а, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими С3а, происходят их соединение и агглютинация.
Реакции с использованием меченых антител или антигенов.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ):
Используется как экспресс-метод диагностики инфекционных заболеваний.
Основана на том, что к иммунной сыворотке добавляют флюорохромы (родомин или флюорисцин), которые способны светиться при люминесцентном облучении.
Такие меченые а/т при взаимодействии и а/г будут образовывать комплексы а/г-а/г и при люминесцентной микроскопии будут светиться. Бактерии в мазке, обработанные такой специфической сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Радиоиммунологический анализ (РИА):
Количественное определение а/т или а/г, меченных радионуклидом, с применением аналогичных а/т или а/г. Образовавшийся радиоактивный комплекс а/г-а/т отделяют от общей смеси и определяют его радиоактивность по счетчику импульсов: количество меченого а/г, связавшегося с а/т, обратно пропорционально количеству искомого а/г.
Идентификация аденовируса в РТГА:
Цель: определение а/г вируса в исследуемом материале:
Компоненты: сыворотка крови, диагностическая противоаденовирусная сыворотка и эритроциты.
Ход: РТГА это вариант РН, основана на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфическими а/т, что проявляется отсутствием агглютинации эритроцитов с формированием на дне лунки компактного осадка (точечка, а не зонтик). К разведениям сыворотки крови больного добавляют равное кол-во аротивоаденовирусной сыворотки (а/т) и инкубируют. После чего добавляют равны объем 1,0% взвеси эритроцитов, снова инкубируют и читают результат. Диагностическим титром считают наибольшее разведение, в котором тормозится гемагглютинация.