Исследование фармакологических свойств гастродии высокой
Материалы и методики
В экспериментальной части работы использовались беспородные животные - белые крысы массой тела 160-180 г и мыши массой тела 18-20 г, колебания веса которых в одной группе были в пределах 10 - 20 г у крыс и 1-2 г у мышей. Опыты проводились в соответствии с действующими "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" и "Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных".
Исследования выполнены в осенне-зимний период на кафедре фармакологии ЯГМА. Объект обследования: 60 белых крысах-самцов и 72 белые мыши. Все животные были распределены на 3 группы. Интактным животным (контрольная группа) внутрибрюшинно вводилась дистиллированная вода, а в экспериментальных группах 70% настойка гастродии в дозе 1мл/кг веса за 30-40 мин. до начала эксперимента.
Острая токсичность определялась на белых мышах по методика Тейтнера-Миллера при внутрижелудочном введении исследуемой 70% настойки гастродии путем оценки смертности животных в течение последующих 2 недель. Контрольным животным вводился 70% раствор этанола в том же объеме. Оценивалась также способность гастродии снижать токсичность этанола, вводимого внутрибрюшинно.
Антигипоксические свойства препарата исследовали на модели нормобарической нормокапнической гипоксической гипоксии, которая моделировалась помещением крыс в гермокамеру объемом 1,5 литра. Углекислый газ удалялся натронной известью. Показателем сопротивляемости животных к воздействию гипоксии являлась продолжительность их жизни.
Сопротивляемость организма к действию предельных мышечных нагрузок исследовали на модели принудительного плавания крыс с грузом 10% от массы тела до полного утомления.
Стресс - синдром моделировали иммобилизацией крыс на спине в течение 24 часов. Изучали следующие показатели: весовые коэффициенты (вес органа в мг делится на вес животного в г) надпочечников и тимуса, изъязвление слизистой оболочки (% животных с язвами и количество язв у одной крысы), индекс Паурса, который рассчитывается по следующей формуле:
Степень изъязвления *% крыс с язвами
Для исследования поведенческих реакций использовался метод "открытого поля". Данный метод заключается в исследовании двигательного компонента ориентировочной реакции и эмоциональной реактивности животных. Метод основан на исследовании в манеже, в затемненном помещении. Наблюдение за животными проводится строго в одно и то же время суток в течение 2 минут при постоянной местной освещенности манежа во время опыта лампой 500 Вт с зеркальным отражателем. Высота лампы над центром манежа 60 см, диаметр манежа 80 см, высота бортика из зеркальной жести 35см. Основание манежа изготавливают из дерева, покрывают белой водоотталкивающей краской и расчерчивают черными линиями на 16 квадратов.
Животных предварительно размещаются по 1 в коробке и спустя 5 минут поступают на опыт в манеж. Визуально подсчитывается количество пересеченных (4 лапами) квадратов при спонтанном перемещении животного. Длина пробега характеризует уровень двигательной активности животных. Одновременно учитывается реакция дефекации по количеству фекальных шариков, которая расценивается как эмоциональная реактивность животных.
Иммуномодулирующая активность гастродии исследовалась в отношении гуморальных и клеточных параметров неспецифического иммунитета: это влияние на активность нейтрофилов и лизоцима крови. В данной группе экспериментов настойка гастродии мышам вводилась внутрижелудочно ежедневно в течение 2 недель.
При определении лизоцимной активности in vivo изучалась его способность вызывать разрушение клеток тест-культуры m. Lyteus. Количество лизоцима оценивали в г/л по степени изменения мутности взвеси тест-культур. Мутность определялась на фотоэлектроколориметре ФЭК-М (Россия). Расчет осуществлялся с помощью калибровочной кривой, построение которой проводилось с помощью чистого препарата лизоцима.
Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по показателю процент фагоцитоза (ПФ), изучая относительное количество нейтрофилов, проявивших фагоцитарную активность. Кровь мышей смешивали с двухмиллиардной взвесью Staphylococcus epidermidis в соотношении 1: 10 и инкубировали при 37° по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации готовили кровяной мазок на предметном стекле. Мазок окрашивают по Романовскому-Гимзе. Учет результатов осуществлялся микроскопически. В мазке при увеличении 90 с иммерсионной системой подсчитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов (показатель фагоцитоза - ПФ). Интенсивность фагоцитоза определяли на основании фагоцитарного индекса (ФИ) - количества объектов фагоцитоза, захваченных одним фагоцитом из ста фагоцитов пробы.
Анализ полученных результатов выполнен с использованием статистической программы "BIOSTATISTICA" Version 4.03 by Stanton A. Glantz (перевод на русский язык©1998 "Практика"). Различия между группами исследованы с помощью t-критерия Стьюдента, с расчетом 95% доверительного интервала для разности средних величин. Уровень статистической значимости был принят p<0,05. Данные представлены в виде M±m.
Результаты и их обсуждение
На начальном этапе исследования было проведено изучение острой токсичности настойки гастродии при внутрижелудочном введении. Проведенные первоначально исследования на токсичность настойки гастродии 70%, показали, что препарат не только относится к малоопасными веществам, но и снижает токсичность этанола не менее чем на 27% (таблица 1).
Таблица 1
Острая токсичность 70% настойки гастродии при внутрижелудочном введении
| Продукт | Доза исследуемого продукта в мл | ||||
| ДМТ | DL16 | DL50 | DL84 | DL100 | |
| Контроль (раствор 70% этанола) | 10,0 | 16,3 | 22,5±4,1 | 27,1 | |
| 70% настойка гастродии | 15,0 | 21,8 | 28,6±3,9 | 34,3 |
ДМТ - доза минимальной токсичности (гибели животных не наблюдается)
DL16, DL50, DL84, DL100 - дозы, при которых наблюдается гибель 16, 50, 84 и 100% животных
Показателем сопротивляемости животных к воздействию гипоксии являлась продолжительность их жизни. Продолжительность жизни крыс в контрольной группе составила 71.2±4.2 минуты, а при использовании настойки гастродии в концентрации 70% - 91.0±4.6минут. Таким образом, при применении 70% настойки гастродии отмечалось достоверное повышение устойчивости к гипоксии подопытных животных в 1.31 раза по сравнению с контролем (таблица 2).
Актопротекторная активность оценивалась по времени плавания крыс с грузом в 10% от веса животного в воде при температуре 320С до полного утомления. Время плавания крыс в контрольной группе (таблица 2) составило 15,2±3,9 минут, а при использовании настойки гастродии - 38,0±4,26 минут, то есть она достоверно повышалась в 2,5 раза..
Таблица 2
Антигипоксическая и актропротективная активность настойки гастродии
| Группы | Гипоксия: продолжительность жизни в мин | Плавание: продолжительность в мин |
| Контроль | 71,2±4,2 | 15,2±3,9 |
| 70% настойка гастродии | 91,0±4,6* | 38,0±4,3* |
* - достоверная разница с контролем (р<0.05)
Изучение действия настойки гастродии на модели иммобилизационного стресса у крыс показало, что ее введение препятствует стрессорной инволюции тимуса, достоверно увеличивая его весовой коэффициент по сравнению с контролем на 32% (таблица 3).
Таблица 3
Стресспротективная активность настойки гастродии
| Группы | Исследуемые показатели | ||||
| весовой коэффициент | Поражение слизистой желудка | ||||
| тимус | надпочечники | Степень изъязвления | % крыс с язвами | коэффициент Паурса | |
| Интактные | 0,60±0,04 | 0,083±0,006 | - | - | - |
| Контроль | 0,45±0,01* | 0,096±0,008 | 5,5±1,1* | 5,5 | |
| Гастродия | 0,58±0,02** | 0,089±0,005 | 2,0±0,6** | 1,0 |
* - достоверная разница с интактными (р<0.05)
** - достоверная разница с контролем (р<0.05)
Также исследуемый препарат активно препятствовал и гипертрофии надпочечников. Особое внимание на себя обращает гастропротективное (защита слизистой желудка от неблагоприятных воздействий) действие настойки гастродии при стрессе. Она не только снижало количество стрессорных язв у подопытных животных, но и в половине случаев препятствовала их образовании. Это свидетельствует о высокой гастропротективной активности гастродии при стрессе и позволяет предположить наличие у препарата противоязвенной активности.
При изучении поведенческих реакций по методике "открытое поле" обнаружено, что настойка гастродии повышала вертикальную компоненту двигательной активности в 1.75 раза, величина же горизонтальной компоненты оставалась практически неизменной. Это свидетельствует о том, что гастродия повышает, прежде всего, активность познавательной компоненты двигательной реакции. Одновременно с этим нарастает в 2,2 раза и эмоциональную активность крыс (рисунок 1).
Рисунок 1. Нейрогенная активность настойки гастродии по методике "открытое поле"
ДА - двигательная активность.
Эмоц. акт. - эмоциональная активность.
* - достоверная разница с интактными (р<0.05)
Иммуномодулирующая активность гастродии исследовалась в отношении гуморальных и клеточных параметров неспецифического иммунитета. который обуславливает первичную резистентность к инфекционным заболеваниям. В качестве параметра, оценивающего клеточный иммунитет, исследовалась фагоцитарная активность нейтрофилов, а параметра, оценивающего гуморальный иммунитет - активность лизоцима. Как показало исследование, настойка гастродии 70% вызывала повышение фагоцитарной активности, как увеличивая число нейтрофилов (в 1,5 раза), принимающих участие в процессе фагоцитоза, так и несколько повышая (на 23%) интенсивность фагоцитоза. Еще более выражено гастродия влияла не гуморальное звено неспецифического иммунитета - уровень лизоцима крови возрастал в 1,9 раза. (таблица 5).
Таблица 5
Влияние настойки гастродии на показатели неспецифического иммунитета у белых мышей
| Группа | Показатель фагоцитоза (ПФ)% | Фагоцитарный индекс (ФИ) | Лизоцимная активность, г/л. |
| Контроль | 3,0 | 2,80 | |
| Гастродия | 60* | 3,7 | 5,25* |
* - достоверная разница с интактными (р<0.05)
Выводы
1. Настойка Гастродии высокой относится к нетоксичным малоопасным веществам.
2. Гастродия высокая значительно повышает устойчивость к экспериментальной гипоксии и обладает актопротекторным действием.
3. Отмечено антистрессорное и особенно значительное противоязвенное действие Гастродии высокой.
4. Гастродия высокая обладает нейротропной активностью, повышая, прежде всего, познавательную и эмоциональную активность крыс.
5. Настойка Гастродии высокой характеризуется иммуномодулирующим действием, что проявляется повышением фагоцитарной активности, усилением гуморального звена неспецифического иммунитета.
Заключение
Проведенный анализ спектра биологической активности настойки Гастродии высокой, продемонстрировал ее разноплановый характер действия при различных моделях патологии, воспроизведенных на белых беспородных крысах и белых мышах. Подобное множественное или плеотропное нормализующее действие характерно для лекарственных препаратов из группы алдаптогенов: женьшеня, аралии маньчжурской, заманихи высокой, элеутерококка колючего, радиола розовой, лимонника китайского и др.
Таким образом, благодаря уникальному химическому составу Гастродии высокой, данное растение может быть отнесено к группе адаптогенов, что делает ее перспективной для дальнейшего исследования с целью создания нового лекарственного препарата, обладающего адаптогенными свойствами.