Белковая природа ферментов обусловливает появление у них ряда свойств, в целом нехарактерных для неорганических катализаторов: олигодинамичность, специфичность, зависимость скорости реакции от температуры, рН среды, концентрации фермента и субстрата, присутствия активаторов и ингибиторов.
Под олигодинамичностью ферментов понимают высокую эффективность действия в очень малых количествах. Такая высокая эффективность объясняется тем, что молекулы ферментов в процессе своей каталитической деятельности непрерывно регенерируют. Типичная молекула фермента может регенерировать миллионы раз в минуту. Надо сказать, что и неорганические катализаторы также способны ускорять превращение такого количества веществ, которое во много раз превышает их собственную массу. Но ни один неорганический катализатор не может сравниться с ферментами по эффективности действия.
Примером может служить фермент реннин, вырабатываемый слизистой оболочкой желудка жвачных животных. Одна молекула его за 10 минут при 37°С способна вызывать коагуляцию (створаживание) порядка миллиона молекул казеиногена молока.
Другой пример высокой эффективности ферментов даёт каталаза. Одна молекула этого фермента при 0°С расщепляет за секунду около 50 000 молекул пероксида водорода:
2 Н2О2 2 Н2О + О2
Действие каталазы на пероксид водорода заключается в изменении величины энергии активации этой реакции приблизительно от 75 кДж/моль без катализатора до 21 кДж/моль в присутствии фермента. Если же в качестве катализатора этой реакции используется коллоидная платина, то энергия активации составляет всего 50 кДж/моль.
7.2.2. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальное значение.
Мерой скорости ферментативных реакций служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. Изменение скорости проводят на начальной стадии реакции, когда продукт ещё практически отсутствует, и обратная реакция не идёт. Кроме того, на начальной стадии реакции концентрация субстрата соответствует его исходному количеству.
7.2.3. Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от концентрации фермента [Е] (рисунок 7.3). При высокой концентрации субстрата (многократно превышающей концентрацию фермента) и при постоянстве других факторовскорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента. Поэтому зная скорость реакции, катализируемой ферментом, можно сделать вывод о его количестве в исследуемом материале.
Рисунок 7.3. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента
7.2.4. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата [S]. График зависимости имеет вид гиперболы (рисунок 7.4). При постоянной концентрации фермента скорость катализируемой реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата до максимальной величины Vmax, после чего остаётся постоянной. Это следует объяснить тем, что при высоких концентрациях субстрата все активные центры молекул фермента оказываются связанными с молекулами субстрата. Любое избыточное количество субстрата может соединиться с ферментом лишь после того, как образуется продукт реакции и освободится активный центр.
Рисунок 7.4. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата может быть выражена уравнением Михаэлиса — Ментен:
,
где V — скорость реакции при концентрации субстрата [S], Vmax —максимальная скорость и KM —константа Михаэлиса.
Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной. Определение KM и Vmax имеет важное практическое значение, так как позволяет количественно описать большинство ферментативных реакций, включая реакции с участием двух и более субстратов. Различные химические вещества, изменяющие активность ферментов, по-разному воздействуют на величины Vmax и KM.
7.2.5. Зависимость скорости реакции от t – температуры, при которой протекает реакция (рисунок 7.5), имеет сложный характер. Значение температуры, при котором скорость реакции максимальна, представляет собой температурный оптимум фермента. Температурный оптимум большинства ферментов организма человека приблизительно равен 40°С. Для большинства ферментов оптимальная температура равна или выше тойц температуры, при которой находятся клетки.
Рисунок 7.5. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
При более низких температурах (0° — 40°С) скорость реакции увеличивается с ростом температуры. При повышении температуры на 10°С скорость ферментативной реакции удваивается (температурный коэффициент Q10 равен 2). Повышение скорости реакции объясняется увеличением кинетической энергии молекул. При дальнейшем повышении температуры происходит разрыв связей, поддерживающих вторичную и третичную структуру фермента, то есть тепловая денатурация. Это сопровождается постепенной потерей каталитической активности.
7.2.6. Зависимость скорости реакции от рН среды (рисунок 7.6). При постоянной температуре фермент работает наиболее эффективно в узком интервале рН. Значение рН, при котором скорость реакции максимальна, представляет собой оптимум рН фермента. У большинства ферментов организма человека оптимум рН находится в пределах рН 6 – 8, но есть ферменты, которые активны при значениях рН, лежащих за пределами этого интервала (например, пепсин, наиболее активный при рН 1,5 - 2,5).
Изменение рН как в кислую, так и в щелочную сторону от оптимума приводит к изменению степени ионизации кислых и основных групп аминокислот, входящих в состав фермента (например, СООН-группы аспартата и глутамата, NН2-группы лизина и т.д.). Это вызывает изменение конформации фермента, в результате чего изменяется пространственная структура активного центра и снижение его сродства к субстрату. Кроме того, при экстремальных значениях рН происходит денатурация фермента и его инактивация.
Рисунок 7.6. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды.
Следует отметить, что свойственный ферменту оптимум рН не всегда совпадает с рН его непосредственного внутриклеточного окружения. Это позволяет предположить, что среда, в которой находится фермент, в какой-то мере регулирует его активность.
7.2.7. Зависимость скорости реакции от присутствия активаторов и ингибиторов. Активаторы повышают скорость ферментативной реакции. Ингибиторы понижают скорость ферментативной реакции.
В качестве активаторов ферментов могут выступать неорганические ионы. Предполагают, что эти ионы заставляют молекулы фермента или субстрата принять конформацию, способствующую образованию фермент-субстратного комплекса. Тем самым увеличивается вероятность взаимодействия фермента и субстрата, а следовательно и скорость реакции, катализируемой ферментом. Так, например, активность амилазы слюны повышается в присутствии хлорид-ионов.
Механизм действия ферментов. Каталитический (активный) центр. Коферменты и кофакторы. Конкурентное и неконкурентное ингибирование. Использование конкурентных ингибиторов как лекарственных препаратов.
Активный центр (Ац) – это часть молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом и принимает непосредственное участие в катализе. Ац, как правило, находиться в нише (кармане). В Ац можно выделить два участка: участок связывания субстрата – субстратный участок (контактная площадка) и собственно каталитический центр.
Большинство субстратов образует, по меньшей мере, три связи с ферментом, благодаря чему молекула субстрата присоединяется к активному центру единственно возможным способом, что обеспечивает субстратную специфичность фермента. Каталитический центр обеспечивает выбор пути химического превращения и каталитическую специфичность фермента.
У группы регуляторных ферментов есть аллостерические центры, которые находятся за пределами активного центра. К аллостерическому центру могут присоединяться “+” или “–“ модуляторы, регулирующие активность ферментов.
Различают ферменты простые, состоят только из аминокислот, и сложные, включают также низкомолекулярные органические соединения небелковой природы (коферменты) и (или) ионы металлов (кофакторы).
Коферменты – это органические вещества небелковой природы, принимающие участие в катализе в составе каталитического участка активного центра. В этом случае белковую составляющую называют апоферментом, а каталитически активную форму сложного белка – холоферментом. Таким образом: холофермент = апофермент + кофермент.
В качестве коферментов функционируют:
· гемы,
· нуклеотиды,
· коэнзим Q,
· ФАФС,
· SAM,
· Глутатион
· производные водорастворимых витаминов:
| Витамины | Коферменты |
| РР (никотиновая кислота) | НАД+, НАДФ+ |
| В2 (рибофлавин) | ФАД, ФМН |
| В6 (пиридоксаль) | Пиридоксальфосфат |
| В1 (тиамин) | Тиаминпирофосфат |
| В12 | Кобаламины |
Кофермент, который присоединен к белковой части ковалентными связями называется простетической группой. Это, например, FAD, FMN, биотин, липоевая кислота. Простетическая группа не отделяется от белковой части. Кофермент, который присоединен к белковой части нековалентными связями называется косубстрат. Это, например, НАД+, НАДФ+. Косубстрат присоединяется к ферменту в момент реакции.
Кофакторы ферментов – это ионы металлов, необходимые для проявления каталитической активности многих ферментов. В качестве кофакторов выступают ионы калия, магния, кальция, цинка, меди, железа и т.д. Их роль разнообразна, они стабилизируют молекулы субстрата, активный центр фермента, его третичную и четвертичную структуру, обеспечивают связывание субстрата и катализ. Например, АТФ присоединяется к киназам только вместе с Mg2+.