Ускоренный метод определения общего азота
В ряде случаев для массовых анализов, особенно при оценке селекционного материала, необходимо использовать более быстрые, чем метод Кьельдаля, способы определения содержания азота в растительных образцах. Наиболее точными являются модификации, разработанные на основе метода Кьельдаля. Один из них — метод ускоренного определения азота с использованием реактива Несслера был разработан 3. В. Чмелевой и С. Л. Тютеревым.
Принцип метода
Растительный материал озоляют с серной кислотой, для ускорения минерализации используют перекись водорода. Раствор нейтрализуют щелочью и окрашивают, реактивом Несслера. По интенсивности окраски определяют содержание азота в исследуемом образце.
Оборудование
Термостойкие пробирки диаметром 2 см и высотой 20 см с точной меткой 40 мл, колбы Кьельдаля на 50 или 100 мл, штативы, электроплитки, фотоэлектроколориметр, или спектрофотометр, мерные колбы емкостью 1 л, 100 мл и 50 мл, градуированные пипетки;
Реактивы
H2SO4 концентрированная, перекись водорода 30%, раствор сегнетовой соли 50%-й, NH4CI, реактив Несслера, лакмусовая бумага.
Приготовление реактива Несслера
Холодный насыщенный раствор хлорной ртути HgC12 осторожно приливают при перемешивании к раствору 13 г KJ в 25 мл дистиллированной воды до появления небольшой мути. Выпадающую муть удаляют фильтрованием. К полученному прозрачному фильтрату прибавляют раствор едкого кали (55 г КОН в 150 мл воды), разбавляют водой до 250 мл и тщательно перемешивают. После этого добавляют по каплям при непрерывном помешивании насыщенный раствор Hg C12 до появления слабого неисчезающего желтоватого осадка. Жидкости над осадком дают отстояться и прозрачный раствор сливают. Реактив хранят в темной склянке.
Ход определения.
1. Для построения калибровочной кривой используют образцовый раствор NH4CI.
При приготовлении этого раствора 0,382 г химически чистого (х. ч.) перекристаллизованного NH4CI растворяют в 1 л бидистиллированной воды и получают исходный раствор с содержанием 0,1 мг азота в 1 мл.
Из этого раствора путем десятикратного разведения готовят образцовый раствор с содержанием 0,01 мг азота в 1 мл.
Шкалу образцовых растворов готовят со следующими концентрациями (мг азота в колбе емкостью 50 мл):
0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,15; 0,20, 0,25.
Для этого в мерные колбы берут 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 или 25 мл образцового раствора, добавляют немного воды, затем но 0,5мл 50%-ного раствора сегнетовой соли и по 2 мл реактива Несслера.
Содержимое колб доводят водой до метки..
2. На аналитических весах отвешивают 100 мг тонкоразмолотой муки и переносят в термостойкую пробирку диаметром около 2 см, высотой 20 см и емкостью 40 мл (с точной меткой). Вместо градуированных термостойких пробирок можно использовать колбы Кьельдаля емкостью 50—100 мл. Если вместо муки для анализа используют другой растительный материал, навеску берут с таким расчетом, чтобы в ней содержалось около 2 мг азота.
3. В пробирки приливают по 3 мл концентрированной серной кислоты и по 0,5 мл 30%-ной перекиси водорода и помещают в гнезда специального металлического блока, установленного на электроплитке (газовой горелке).
4. Озоление растительного материала проводят при температуре около 400°С. Не следует допускать бурного кипения смеси.
5. Для ускорения минерализации органических веществ через 1 ч после начала кипения в пробирки или колбы осторожно добавляют еще по 0,5 мл перекиси водорода. Нагревание продолжают до полного обесцвечивания содержимого пробирок.
6. После окончания озоления пробирки выдерживают еще 15—20 мин для окончания разложения перекиси водорода.
7. Затем в охлажденные пробирки очень осторожно приливают воду примерно до половины объема.
8. Содержимое пробирок вновь охлаждают, доводят водой до метки (40 мл), закрывают.пробками и тщательно перемешивают.
Если вместо мерных термостойких пробирок для сжигания использовали колбы Кьельдаля, после охлаждения в них добавляют по 15-20 мл воды и содержимое количественно переносят в мерные колбы емкостью 50 мл. Колбы Кьельдаля тщательно обмывают несколько раз небольшими объемами воды и сливают их в мерную колбу. Затем колбы доводят, водой до метки, закрывают пробками и перемешивают.
9. После этого готовят растворы для колориметрирования.
A) В мерные колбы емкостью 50 мл наливают примерно по 20 мл воды.
Б) Затем из пробирок, и которых проводилось сжигание, или из колб, в которые был перенесен раствор после сжигания, берут точно по 2—5 мл вытяжки (в зависимости от предполагаемого содержания азота в исследуемых образцах) и переносят в мерные колбы.
B) Содержание колб нейтрализуют 10%-ным раствором NaOH (обычно на 1 мл вытяжки расходуют около 1 мл 10.%-ной щелочи). Конец нейтрализации определяют по посинению лакмусовой бумажки, на которую наносят из колбы каплю раствора стеклянной палочкой.
Г) Чтобы избежать появления опалесценции раствора, в колбы добавляют по 0,5 мл 50%-го раствора сегнетовой соли и приливают по 2 мл реактива Несслера. Необходимо строго соблюдать порядок добавления реактивов.
Д) Колбы доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают.
В результате реакции между аммиаком и реактивом Несслера раствор окрашивается при малом содержании азота - в желтый цвет, при более высоком - в оранжевый.
Растворы должны быть совершенно прозрачными. Интенсивность окраски растворов определяют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром или на спектрофотометре при 410 нм.
Вычисление результатов
Содержание азота рассчитывают по калибровочной кривой.
Пример
Навеска муки 0,100 г. После сжигания в пробирке из общего объема 50 мл. берут 2 мл.,что соответствует 0,004 г. муки. Если сжигали в колбе Кьельдаля, а затем переносили раствор в колбу емкостью 50 мл., то 2 мл соответствуют 0,004 г муки.
По калибровочному графику нашли, что опттическая плотность испытуемого раствора, равная 0,505, соответствует концентрации 0,139 мг азота в колбе емкостью 50 мл..
Таким образом, общее содержание азота в муке равно:
0,139-100
0,004-1000 =2,78%,
где 0,004г. - навеска муки из общей m, 0,139 - с' по графику, 1000 - перевод мг.в г., 100 - для расчета в %.
Умножая найденное количество азота на коэффициент 5,7 (для пшеницы), определяют содержание азота в воздушно-сухой муке: 2,78-5,7=15,85%. Для перевода на абсолютно сухое вещество этот результат умножают на коэффициент влажности муки.
Авторы метода указывают, что опытный аналитик в течение рабочего дня может проанализировать 40-50 образцов в двух параллельных навесках.
Определение содержания связанной воды.
Ход анализа.
1. 3-5 г высушенного растительного сырья, измельченного на мясорубке, помешают в предварительно взвешенный бюкс.
2. Бюкс с навеской (вместе со снятой крышкой) ставят в сушильный шкаф (105°С), при этом температура падает.
3. Первое взвешивание проводят через 2 часа, сырье высушивают до постоянной массы (постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями после 30 минут высушивания и 30 минут охлаждения в эксикаторе не превышает 0,01 г).
4. Процентное содержание влаги в сырье (А%) вычисляют по формуле:
A = 
m1 - масса навески сырья до высушивания, г; m2 - масса сырья после высушивания, г
5. За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое 3 параллельных определений, вычисленных до десятых долей процента. Допускаемое расхождение между результатами 3 параллельных определений не должно превышать 0,5%.