Из дальнейшего будет ясно, что хроматографические процессы протекают тем быстрее (какой бы природы они не были), чем меньше размер гранул. Быстрее устанавливается определенное равновесие между содержанием фракционируемых молекул или ионов внутри гранул и в протекающей между ними жидкости — элюенте. При соответствующих изменениях состава элюента быстрее осуществляется «насыщение» внутреннего объема гранул связанными молекулами вещества или, наоборот, происходит полный выход этих молекул из гранул в ток элюента.
В обычной жидкостной хроматографии низкого давления используют сферические гранулы в широком диапазоне размеров (диаметром 20—300 микрон). Для обеспечения необходимой скорости протекания жидкости даже через длинные колонки с наиболее мелкими гранулами из этого диапазона достаточно создать перепад давления на колонке в 3-4 атмосферы. Процесс хроматографического фракционирования при этом занимает несколько часов.
С середины 70-х годов, когда открылись перспективы хроматографического контроля за технологическими процессами в пищевой и фармакологической промышленности, в интересах ускорения такого контроля многие фирмы стали пробовать переходить на размеры гранул в 10,5 и даже 3 мкн. Однако оказалось, что для обеспечения быстрого протекания элюента через колонки, наполненные столь мелкими гранулами, требуется создавать перепад давления в 200-300 атмосфер на колонку. Физически это можно объяснить двумя причинами. Во-первых, слои свободной жидкости между хорошо упакованными гидрофильными гранулами становятся так тонки, что начинает сильно сказываться жидкостное трение в элюенте. Во-вторых, столь малые гранулы трудно сделать сферическими и притом избежать как значительного разброса их диаметров, так и засорения промежутков между гранулами совсем мелкими обломками. («Отмучивание» в этих условиях малоэффективно.)
|
|
Математически можно доказать, что при заполнении некоего фиксированного объема (колонки) относительно малыми сферическими частицами строго одинакового размера доля свободного объема остается одинаковой вне зависимости от диаметра частиц. Но если свободное пространство между ними забивает «пыль», то сопротивление протеканию жидкости через такую упаковку возрастает многократно.
Все это не остановило конструкторов аппаратуры для хроматографии. Были созданы разборные колонии из легированной стали, рассчитанные на такие давления и соответствующие уплотнительные устройства на их входе и выходе, а также для впрыскивания исследуемых препаратов. Появились мощные плунжерные насосы с кулачковым приводом (как у клапанов автомобильного мотора). Разумеется, все приборы, стоящие после колонки, на стороне атмосферного давления (денситометры, коллекторы фракций) остались теми же, что для обычной хроматографии.
Высокое давление повлекло за собой повышенные требования к жесткости самих гранул. Их стали изготавливать на основе окиси кремния («силикагеля»).
Выигрыш в скорости проведения хроматографии при высоком давлении очевиден. Но в лабораторных условиях, как правило, не играет существенной роли длится хроматографический процесс несколько часов или несколько минут. Если только в этот процесс не вмешивается диффузия разделенных препаратов уже в элюенте, в ходе их элюции из колонки. Для низкомолекулярных веществ фактор диффузии может играть серьезную отрицательную роль, чего нельзя сказать о молекулах белков и других биополимеров.
|
|
Видимо, исходя из соображений диффузии, первые рекламы фирм, изготавливающих аппаратуру для общепринятого наименования процесса «HPLC-chromatography» расшифровывали это наименование не просто как High Pressure Liquid Chromatography, a как High Performance Liquid Chromatography. Казалось, что новый подход скоро вытеснит хроматографию при низком давлении. Однако этого не произошло. Время все расставило по своим местам: в каталогах 2001 года аппаратура, колонки, гранулы для обычной хроматографии занимают такое же место, как аппаратура высокого давления. В описаниях методик лабораторных экспериментов использование обычной хроматографии встречается чаще, чем ЖХВД. В немалой степени это, конечно, определяется и намного более высокой стоимостью аппаратуры высокого давления.
В начале 80-х годов шведская фирма «Pharmacia» выпустила на рынок сравнительно недорогой «промежуточный» вариант комплекта хроматографической аппаратуры под названием «FPLC» (Fast Protein Liquid Chr.) По понятным после отмеченного выше причинам, фирма уделила особое внимание однородности гранул. Вместо обычно разброса диаметров в =ь40% от номинала, фирма сумела наладить выпуск сферических гранул различного назначения диаметром 10 ± 0,1 микрон (т. е. с разбросом в 1%). Это позволяет, несмотря на малый размер гранул ограничиться давлением в 30-50 атмосфер. Разделение белков при этом занимает 5-20 минут. Колонки — стальные, насосы плунжерного типа, но стеклянные.
Судя по имеющимся сведениям, эта система завоевала популярность у современных исследователей.
Поскольку по существу хроматографических процессов все три подхода совершенно одинаковы, я ограничусь сделанными краткими замечаниями относительно систем HPLC и FPLC и буду далее описывать принципы работы и приводить некоторые примеры для варианта обычной хроматографии при низком давлении.
Литература
1. Насыров Х.М., Кондратенко Р.М. К прооксидазному действию медиаторов воспаления. // Пат. физиология. 1992. N 3.-С.-12-14.
2. Неговский В.А. Общие проблемы постреанимационной патологии мозга. // Межд. симпозиум "Постреанимационная патология мозга": Материалы. Тезисы докладов. - М. 1978. -С.82-85.
3. Никитин Ю.П., Курилович С.А., Давидин Г.С. Печень и липидный обмен. - Новосибирск. Наука, -1985.