Исчерпывающая физическая карта генома человека должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом. К решению такой грандиозной по объему задачи привлечены многие хорошо финансируемые лаборатории в разных странах мира, оснащенные автоматическими высокопроизводительными секвенаторами.
Создание в середине 70-х годов теперь уже прошлого века двух различных методов расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК. Хронологически первым был метод Максама - Гилберта. В его разработке большую роль сыграл академик Андрей Дарьевич Мирзабеков. Английский ученый Фред Сэнгер предложил другой способ расшифровки структуры ДНК. За разработку этих методов Гилберт и Сэнгер получили Нобелевскую премию. Интересно, что для Сэнгера эта премия уже вторая, первую он получил за расшифровку аминокислотной последовательности белка инсулина. Случай в науке уникальный - один и тот же человек первым расшифровал структуру и белка и ДНК!
- Метод Максама - Гилберта состоит в том, что молекулу ДНК разбивают на кусочки, затем эти кусочки подвергают химическим воздействиям, потом специальным образом обрабатывают. Ученые смотрят, что при этом происходит с нуклеотидной последовательностью, и на основании этого делают вывод о порядке расположения нуклеотидов друг за другом в каждом фрагменте ДНК.
Согласно методу Сэнгера молекулу ДНК с помощью специальной обработки ферментами не только расщепляют на фрагменты, но и "расплетают" ее двойную спираль на две нити. Потом по каждому из полученных обрывков, состоящих из отдельных нуклеотидных "нитей", с помощью специальных химических "затравок" восстанавливается недостающая вторая нить нуклеотидов. Но не полностью - ее синтез обрывают на разных нуклеотидах. При этом получался набор цепей ДНК с непрерывно изменяющейся длиной - "лесенка". Фрагменты разной длины помечены на концах флуоресцентной меткой, чтобы их было легко обнаружить.
Надо сказать, что российские биологи внесли существенный вклад в разработку и этого метода. Новосибирский ученый профессор Станислав Константинович Василенко предлагал принцип "лесенки" еще до публикации работ Сэнгера, этот же принцип развивал и академик Евгений Давыдович Свердлов, директор Института молекулярной генетики РАН. То, что Василенко и Свердлов - предтечи Сэнгеровского метода, забывать не стоит.
Все автоматы-секвенаторы построены по принципу метода Сэнгера, поскольку он оказался более удобным для автоматизации и комьютерной регистрации. Выпущено огромное количество автоматов и стандартных наборов реактивов для анализа. По сути, секвениро вание (то есть определение нуклеотидной последовательности ДНК) стало рутинной лаборантской работой. А метод Максама-Гилбера имеет скорее историческое, чем практическое значение.
Еще 15-20 лет назад расшифровка нуклеотидной последовательности в 1000 нуклеотидов считалась почти научным подвигом, за это можно было сразу получить степень доктора наук. Но уже к 1990 году секвенирование ДНК стало массовой технологией. А сейчас квалифицированный лаборант проделывает такую работу меньше, чем за один день.
Разработаны и другие совершенно новые методы секвенирования. Один из них базируется на возможности избирательно присоединять тяжелые атомы металлов (нерадиоактивные изотопы) к определенным нуклеотидам с последующим масс-спектрометрическим сканированием молекул ДНК, пропускаемых через тончайший (нанометровый) микрокапилляр. Устройство читает нуклеотидную последовательность практически безошибочно. При этом не нужно дорогостоящих и отнимающих уйму труда операций по химическому секвенированию, использованию наборов рестрикционных ферментов и прочих ухищрений. Метод начала использовать компания "Секвеном", зарегистрированная в городе Сан-Диего (Калифорния) и руководимая Чарлзом Кэнтором.
Другой подход основан на присоединении флюоресцентных меток к ДНК, разрезании ДНК одним или несколькими рестрикционными ферментами на достаточно протяженные куски и оптическом анализе кусков. Так как флюоресцентные метки, сорбирующиеся на индивидуальных нуклеотидах, создают для каждого участка ДНК светящуюся картинку, характерную только для него, можно сравнивать ее с имеющимися в памяти компьютеров картинками. Для этого сотрудники компании "Силера джиномикс" создали прибор оптического "обстрела" протяженных ДНК (система Visionade) и математический алгоритм Gentig. Если после оптического просмотра остаются сомнения в точности нуклеотидных последовательностей в каких-то коротких участках, только эти участки и надлежит секвенировать химически. Оптическая "стрельба" по нарезанным участкам ДНК позволила достичь небывалой скорости в секвенировании: в свое время изучение генома кишечной палочки потребовало работы нескольких сот человек в течение 12 месяцев, в то время как система Visionade помогла расшифровать этот же геном в несколько минут.