Строение и функции нуклеиновых кислот.

1. Функции ДНК и РНК. Типы РНК.

2. Первичная структура ДНК и РНК.

3. Вторичная структура ДНК. Полиморфизм вторичной структуры ДНК.

4. Третичная структура ДНК: принципы организации и стабилизации.

5. Четвертичная структура ДНК.

6. Вторичная и третичная структура РНК.

7. Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот.

 

Лабораторная работа №5.

«Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови».

Креатинкиназа катализирует превращение креатина в креатинфосфат. Ион фосфора, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорнованадиевомолибденовой кислоты.

 

Реактивы:

1. Раствор сравнения (фосфор 1,20 ммоль/л).

2. Раствор реактива (аммоний ванадиевокислый 2 ммоль/л в 0,5 М хлорной кислоте и аммоний молибденовокислый 30 ммоль/л).

3. Раствор активатора (цистеина хлорид).

4. Раствор трихлоруксусной кислоты 0,15 моль/л.

5. Буферный раствор (глицин, углекислый натрий, сернокислый магний).

6. Субстрат - стандартный раствор (глицин, углекислый натрий, сернокислый магний, креатин).

7. Раствор двунатриевой соли АТФ.

 

Проведение анализа:

 

1. На фотоколориметре установить длину волны 390-410 нм, кювета 10мм Помечают цифрами 4 пробирки.

2. В пробирки 1 и 3 помещают по 0,5 мл раствора №6 (субстрата – 10 кап).

3. В пробирки 2 и 4 помещают по 0,5 мл раствора №5 (буфера-10 кап.)

4. В пробирку 3 помещают 0,05 мл раствора сравнения №1 (1 кап.).

5. В пробирку 1 помещают 0,2 мл раствора активатора №3 (4 кап.).

6. В пробирку 1 и 2 помещают по 0,05мл (1кап) сыворотки крови.

7. В пробирки 2 и 3 добавляют по 0,2 мл (4 кап) бидистиллироанной воды, в пробирку 4 – 0,25 мл (5 кап.).

8. Содержимое пробирок перемешивают и предварительно инкубируют 5 мин при 37⁰ С.

9. Во все пробирки отмеряют по 0,1мл (2 кап.) раствора АТФ(№7), перемешивают и инкубируют точно 60 мин. при 37⁰С.

10. Во все пробирки отмеряют по 0,3 мл (6 кап.) раствора трихлоруксусной кислоты №4.

11. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

12. В чистые пробирки отмеряют по 0,9 мл (18 кап.) надосадочной жидкости, добавляют по 1,2 мл раствора реактива №2, перемешивают и через 5 мин. измеряют оптическую плотность всех растворов относительно воды (А₁, А₂, А₃, А₄).

 

Расчет результатов:

 

Каталитическую активность креатинкиназы (Х) в мккат/л рассчитывают по формуле:

 

(А₁-А₂)

Х=0,33х---------------

(А₃-А₄)

 

Лабораторная работа 6

«Выделение дезоксирибонуклеопротеидов из тканей животных»

Дезоксирибонуклеопротеиды выделяют из тканей, богатых клеточными ядрами: из зобной железы, селезенки и др. Дезоксирибонуклеопротеиды растворяются в растворах солей средней концентрации, например в хлориде натрия (1М), с образованием вязких растворов и снова осаждаются при разведении их (до 0,15М) в виде нитей нуклеопротеидов.

Исследуемый материал: ткани лабораторных животных.

Реактивы: 2 М и 1 М растворы NaCl, содержащие 0,04% трехзамещенный цитрат натрия;

Оборудование: центрифужные пробирки, центрифуга, ступка с пестиком, стакан химический на 100 мл, пипетка на 10 мл, цилиндр мерный на 50 мл.

Ход работы

В ступке, охлаждаемой льдом, растирают ткань животного с равным количеством кварцевого песка, затем постепенно добавляют 5 мл охлажденного 2 М раствора NaCl, содержащего 0,04% трехзамещенного цитрата натрия, растирают в течение 15 минут.

Затем, перемешивая содержимое в ступке, постепенно, малыми порциями добавляют 50 мл охлажденного 1М раствора NaCl.

Образовавшуюся гомогенную массу переносят в центрифужные пробирки, обязательно уравновесив их, и центрифугируют их 15 минут при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость после центрифугирования сливают в маленький стакан, измеряют цилиндром объем полученного центрифугата и медленно вливают его в шестикратный объем дистиллированной воды тонкой струей, размешивая жидкость палочкой.

Выделившийся хлопьевидный осадок отстоять, осторожно слить с него жидкость, а оставшуюся часть подвергнуть центрифугированию. Препарат этот сохраняют до следующей работы.

Лабораторная работа 7.

«Определение состава биополимера по результатам качественных реакций на продукты его гидролиза».

Исследуемый материал: дезоксирибонуклеопротеиды печени и селезенки крысы, выделенные ранее.

Реактивы: 5% раствор серной кислоты, 10% и 30% раствор гидроксида натрия, 1% и 7% раствор CuSO₄, 1% раствор AgNO₃, молибденовый реактив.

Оборудование: коническая колба с обратным холодильником, песчаная баня, воронки, бумажные фильтры, штатив с пробирками, пипетки.

 

Ход работы

В коническую колбу для гидролиза помещают 4 г исследуемого вещества и добавляют 32 мл 5%-ного раствора H₂SO₄, к колбе присоединяют обратный холодильник с водяным охлаждением и ставят на песчаную баню для нагревания. Через 1 час после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, гидролизат остужают и дважды фильтруют его через складчатый фильтр. В фильтре определяют продукты гидролиза по результатам качественных реакций.

 

1. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ: к 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10%-ного раствора NaOH и 1 капля 1%-ного раствора CuSO₄.

2. СЕРЕБРЯНАЯ ПРОБА на пуриновые основания: 10 капель гидролизата нейтрализуют 1 каплей NH₄OH и добавляют 5 капель 1%-ного раствора AgNO₃. При наличии пуриновых оснований появляется рыхлый буроватый осадок серебряных соединений аденина и гуанина.

3. ПРОБА ТРОММЕРА: к 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30%-ного раствора NaOH и 3 капли 7%-ного раствора CuSO₄. Жидкость перемешивают и нагревают до начала кипения.

4. МОЛИБДЕНОВА Я ПРОБА: к 20 каплям молибденового реактива добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут.

Записывают результаты проведенных экспериментов (для молибденовой реакции записывают уравнению). На основании полученных данных делают вывод о составе биополимера.