Параметры количественного определения:
h (S)- высота (площадь) пика вещества,
hст (S)- высота (площадь) пика внутреннего стандарта
Фотоколориметрический метод. Определение проводят в отдельной навеске объекта. Из 200-300 г биологического материала, после подкисления его щавелевой кислотой, отгоняют 250-300 мл дистиллята. В полученном дистилляте нейтрализуют летучие кислоты, добавляя 10% раствор гидрокарбоната натрия, и путем двукратного дефлегмирования отгоняют вначале 100, а затем 14 мл жидкости, в которой определяют метиловый спирт по реакции окисления его до формальдегида с последующим получением окрашенного соединения с фуксинсернистой кислотой. Измеряют величину оптической плотности полученного окрашенного раствора и содержание метилового спирта рассчитывают, используя калибровочный график.
Предел обнаружения составляет 0,05 мг метилового спирта в исследуемой пробе или 0,15-0,2 мг в исследуемом объеме дистиллята.
Ситуационная задача.
В антидопинговую лабораторию доставлена моча спортсменки С., занявшей 1 место в соревновании по бегу. Предложите схему химико-токсикологического исследования объекта с целью определения лекарственного средства, которое обладает стимулирующим действием на ЦНС, относится к списку Прекурсоров (IV список ПП № 681), и из него получают другое более сильное наркотическое средство, относящееся к списку веществ, оборот которых на территории РФ запрещен (I список ПП № 681).
Ответ.
Исходя из обстоятельств дела, можно предположить прием в качестве допинга производного фенилалкиламина. Предположительно амфетамин, метамфетамин или эфедрон, которые являются мощными психостимуляторами и увеличивают физическую активность и работоспособность.
Объекты исследования: моча.
Изолирование из мочи следует проводить методом прямой жидкость-жидкостной экстракции органическим растворителем (например хлороформом) при селективных для фенилалкиламинов значениях рН среды 12, (т.к. они являются относительно других лекарственных веществ более сильными основаниями). Для разрушения водорастворимых метаболитов и увеличения степени экстракции можно провести кислотный гидролиз: мочу подкисляют 25 % кислотой серной до рН-2-3, нагревают на кипящей водяной бане 5 мин, охлаждают. Для максимального изолирование из мочи возможно применение ферментативного гидролиза β-глюкуронидазой/арилсульфатазой.
Рекомендуется для изолирования производных фенилалкиламинов из мочи использовать твердофазную экстракцию. Для очистки извлечений предложена реэкстрация при разных значениях pH.
Обнаружение
Для обнаружения производных фенилалкиламинов используют хроматографию в тонком слое сорбента, УФ-спектрофотометрию, ВЭЖХ, ГЖ, ГХ/ МС и химический метод.
Хроматография в тонком слое сорбента. Остаток после испарения экстракта из водной вытяжки при рН=11-12 наносят на пластинки «Сорбфил». Параллельно на стартовую линию наносят спиртовые растворы «стандартов» (по 10-15 мкг) эфедрина, эфедрона, метамфетамина. Пластинки помещают в системы растворителей бензол - этанол - диэтиламин (9:1:1), хлороформ - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака (20:20:3:1) или толуол - этанол - триэтиламин (9:1:1). После пробега фронта растворителя на расстояние 10 см пластинку вынимают, высушивают и фенилалкиламины обнаруживают путем обработки пластинки реактивом Драгендорфа - появляются оранжевые пятна. При опрыскивании пластинки раствором нингидрина в ацетоне (или н-бутаноле) и при нагревании в сушильном шкафу при 70-80°С эфедрин и эфедрой образуют пятна на пластинке, окрашенные в синий или сине-фиолетовый цвет, амфетамин - пятна голубого цвета, метамфетамин - желто-коричневого. При анализе с использованием системы растворителей бензол - этанол - диэтиламин (9:1:1) Rf для эфедрина составляет 0,41 ±0,02, для эфедрона - 0,65±0,02, для метамфетамина - 0,42±0,02.
УФ-спектрофотометрия используется после очистки извлечений (экстрактов) из мочи с помощью хроматографии в тонком слое сорбента и элюировании с пластинки очищенных соединений 0,1 М раствором хлороводородной кислоты. Амфетамин и метамфетамин в среде хлороводородной кислоты имеют три полосы поглощения с максимумами при 251, 257 и 263 нм.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. Для обнаружения фенилалкиламинов с помощью ВЭЖХ рекомендуются следующие условия (С.К.Еремин): прибор «Милихром», колонка 62х2 мм, сорбент обращенно-фазовый «Сепарон С-18» (5 мкм), подвижная фаза (элюент) - смесь водного 0,2 М раствора ортофосфорной кислоты, метанола и диэтиламина 75:20:1, детектирование при 210 нм, скорость элюирования - 50 мкл/ мин, объем вводимой пробы - 7 мкл, масштаб чувствительности - 0,4 е.о.п.
Обнаружение производных фенилалкиламинов проводят по времени (объему) удерживания.
Газохроматографический анализ в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС). Проводится после получения фторпроизводных с использованием детектора по захвату электронов.
Сухой остаток после испарения экстракта из водной вытяжки с рН=11-12 растворяют в 0,5-1 мл толуола и добавляют соответствующий реактив для перевода фенилалкиламинов в летучее фторпроизводное. Смесь нагревают до 60°С 30 мин. Обнаружение фенилалкиламинов проводят по времени удерживания и характерным линиям, выражающим отношение m/z в масс- спектре.
Химический метод. Из химических реакций для обнаружения производных фенилалкиламинов используют реакции окрашивания.
Реакции окрашивания. Проводятся на фарфоровых чашках с сухими остатками, полученными после испарения экстрактов из мочи.
Реакция с реактивом Марки. На сухой остаток наносят реактив Марки. При наличии амфетамина наблюдают оранжевое окрашивание, переходящее постепенно в коричневое. При наличии метамфетамина образуется желто-зеленое окрашивание.
Реакция с нингидрином. При добавлении к сухому остатку гидроксида натрия до рН=8,5, раствора нингидрина и последующем нагревании амфетамин образует розово-оранжевое, метамфетамин - зеленое.
Количественное определение
Для количественного определения фенилалкиламинов используют фотометрический метод и высокоэффективную жидкостную хроматографию.
1. Экстракционно-фотометрический метод используется для определения в моче. 5 мл мочи подщелачивают 0,5% раствором гидроксида натрия до рН=12 и экстрагируют 3 раза 20 мл диэтиловом эфира. Эфирные экстракты объединяют и испаряют досуха. Остаток переносят в колориметрическую пробирку, добавляют до насыщения кристаллический сульфат натрия и смешивают с 1 мл аммиачного раствора сульфата меди и 3 мл 5% раствора сероуглерода в бензоле.
Слой бензола окрашивается в желтый цвет. Оптическую плотность измеряют с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра при длине
волны 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет количества в моче проводят по калибровочному графику.
2. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Условия определения описаны в разделе «Обнаружение фенилалкиламинов». Для количественного анализа применяют метод добавок. С этой целью проводят анализ экстракта из биологического объекта с добавлением в него известного количества обнаруженного фенилалкиламина.
Метод внешнего стандарта. Вначале проводят анализ экстракта из биологического объекта, а затем анализ эталонного раствора обнаруженного вещества с концентрацией, близкой к концентрации исследуемого соединения в экстракте.
Метод внутреннего стандарта. К объекту добавляют известное количество вещества, принятого за «стандарт».