Принцип метода: формольный метод определения общего белка и казеина в молоке основан на способности аминогрупп белковой молекулы взаимодействовать с формальдегидом с образованием Шиффовых оснований:
Н
/ R-CH-COOH
R-CH-COOH + о = с = | + н2о
| \ n = ch2
nh2 н
Свободные кислотные группы оттитровывают раствором щелочи:
R-CH-COOH R-CH-COONa
| + NaOH = | +H20
N=CH2 N=CH2
О содержании белка судят по количеству щелочи, пошедшей на титрование.
Реактивы и оборудование: 1%-ный спиртовой раствор
фенолфталеина, 1н. раствор гидроксида натрия, формалин, молоко, бюретка, пипетка на 10 мл, конические колбы на 100мл.
Ход работы:
Отмерить в колбу № 1 10мл молока, добавить 10-12 капель раствора фенолфталеина, перемешать и оттитровать 0,1н. раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании. Количество щелочи не учитывать.
Приготовить нейтрализованную формольную смесь. Для этого отмерить в колбу № 2 5мл формалина, добавить 2-3 капли фенолфталеина и оттитровать раствором гидроксида натрия до слабо-розовой окраски. Количество щелочи не учитывать.
В колбу № 1 прилить 2мл нейтрализованной формольной смеси, размешать. Розовое окрашивание исчезает.
Оттитровать содержимое колбы № 1 раствором щелочи, учитывая ее количество, до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при перемешивании.
Рассчитать количество общего б елка в молоке по формуле:
Б = 1,94 х V, где Б- содержание общего белка, %;
V – объем 0,1 н.раствора щелочи, пошедшей на титрование, мл;
1,94 - коэффициент, показывающий количество общего белка, эквивалентное 1 мл О,1н.раствора щелочи.
Рассчитать количество казеина в молоке по формуле:
К= 1,51 х V щел, где К — содержание казеина, %;
V - объем 0,1 н.раствора щелочи, пошедшей на титрование, мл;
1,51 - коэффициент, показывающий количество казеина, эквивалентное 1 мл 0,1 н.раствора щелочи.
Опыт 2. Выделение из молока казеина.
Принцип метода: при добавлении к молоку слабого раствора кислоты казеин выпадает в осадок в виде мелких хлопьев. По мере прибавления кислоты хлопья укрупняются, а при ее избытке они могут вновь раствориться. При естественном скисании молока казеин образует под воздействием молочной кислоты плотный сгусток.
После удаления из молока казеина получается молочная сыворотка, содержащая альбумины, глобулины, лактозу, минеральные соли. Жиры захватываются остатком казеина.
Реактивы и оборудование: 2% раствор сульфата меди, 1%гный
раствор гидроксида натрия, 5% раствор уксусной кислоты, молоко, дистиллированная вода, конические колбы на 100мл, цилиндр на 50мл, бюретка, мерная пробирка, воронка, марля, фарфоровая чашка, стеклянная палочка.
Ход работы:
Отмерить в колбу 10мл молока и 50мл дистиллированной воды, перемешать.
Прилить из бюретки по каплям раствор уксусной кислоты до появления заметных хлопьев казеина.
Осадок казеина отфильтровать через два слоя марли. Фильтрат оставить для следующего опыта.
Осадок перенести в форфоровую чашечку и добавить раствор гидроксида натрия до растворения казеина. Жир при этом находится во взвешенном состоянии.
Профильтровать жидкость через влажный фильтр. Жир задерживается на фильтре.
С фильтратом провести биуретовую реакцию: к 1-2мл фильтрата прибавить 1-2 капли раствора сульфата меди, появление фиолетового окрашивания укажет на присутствие в фильтрате белка.
Опыт З. Выделение из молока лактоальбумина и лактоглобулина.
Принцип метода: л акта альбумин и лактоглобулин выпадают в осадок при нагревании свыше 80° С. Это свойство используется при определении степени пастеризации молока. Кроме того, альбумин может быть выделен при действии на него раствором сульфата аммония, а глобулин - при действии раствором сульфата магния.
Реактивы и оборудование: стакан с фильтратом (полученный в опыте №2); воронки с фильтрами; колбы на 50 мл; штатив с пробирками; хлорид натрия, насыщенный раствор; 30%-ный гидроксид натрия; 1%-ный сульфат меди.
Ход работы:
Фильтрат от первого осадка, имеющий кислую реакцию от прибавления уксусной кислоты при осаждении казеина, смешивают с насыщенным раствором хлорида натрия (1:1) и кипятят. Происходит осаждение лакто альбумина и лакто глобулина.
Содержимое фильтруют. Осадок промывают, растворяют в дистиллированной воде и с полученным раствором проводят цветные реакции на белок (биуретовая реакция).
Биуретовая реакция. К 1-2 мл раствора белка прибавить двойной объем 30%-ного гидроксида натрия, хорошо перемешать и добавить 2-3 капли 1%- нош раствора сульфата меди. Тщательно перемешать. Развивается красно - фиолетовое окрашивание.