Электрофорез
Большинство биологических полимеров содержат заряженные группы, поэтому они способны двигаться в электрическом поле. Движение частиц в растворителе под влиянием электрического поля называется электрофорезом.
Скорость перемещения макромолекул в электрическом поле служит их полезным характеристикой. Это свойство можно использовать для определения молекулярной массы белков, для разделения смесей белков.
Существует три типа электрофореза: с подвижной границей, зональный и непрерывный.
Метод электрофореза с подвижной границей является аналитическим методом, использующимся в первую очередь для определения подвижности и изоэлектрических точек белков, однако, в связи с тем, что здесь обычно трудно количественно определить подвижности, этот метод используется сравнительно редко.
В зональном электрофорезе пятно или тонкий слой раствора, нанесенного на полутвердый или гелеобразный материал, помещают в электрическое поле, в результате чего молекулы перемещаются по или через материал носителя. Поскольку образец наносится в виде зоны, для полноты разделения приходится использовать небольшие количества вещества. Метод используется для анализа смесей, определения чистоты, а также очистки.
Электрофорез на бумаге
Полоску бумаги сначала погружают в буферный раствор, а затем помещают в камеру. Далее образец наносят либо в виде пятна, либо в виде линии. После окончания разделения бумагу вынимают и высушивают. Если образец содержит достаточное количество вещества, оно может быть обнаружено по его окраске, по флуоресценции или при окрашивании различными красителями. Если требуется количественное определение, вещество можно элюировать и определить спектрофотометрически. Так как элюирование красителя редко бывает количественным, точность такого определения составляет около 20 %. Низковольтный электрофорез мало эффективен для небольших молекул (например, аминокислот и нуклеотидов), поскольку из-за малого заряда они обладают низкой подвижностью и следовательно, медленно делятся.
В высоковольтном электрофорезе скорость разделения увеличивается за счет использования градиента потенциала 200 В/см. Высокое напряжение обуславливает большую силу тока, бумага нагревается, поэтому здесь необходимо охлаждение. Для охлаждения бумагу погружают в большой объем несмешивающейся и не проводящей ток жидкости или прижимают ее к охлаждающей поверхности. Метод погружения используется редко, поскольку применяемые охлаждающие жидкости (например, толуол, четыреххлористый углерод или различные масла) являются токсичными. Метод закрытой бумаги находит более широкое применение. В данном случае бумага не погружается в буфер. После окончания электрофореза бумагу высушивают, а вещества определяют также как и при низковольтном электрофорезе.
Высоковольтный электрофорез на бумаге имеет большую ценность для разделения аминокислот и пептидов. Поскольку полное разделение смесей не всегда возможно при использовании одного высоковольтного электрофореза, его часто используют в сочетании с хроматографией; этот метод известен под названием двумерного разделения. Образец вначале подвергают электрофорезу, а затем хроматографируют под прямым углом или наоборот.
Гель электрофорез
Лучшего разделения, в частности, белков и нуклеиновых кислот, можно достигнуть, если в качестве носителя использовать гели крахмала, полиакриламида, акриламида.
В настоящее время крахмальный гель используют редко, поскольку более удобным оказался полиакриламидный гель. При использовании полиакриламидного геля можно контролировать эффект молекулярного сита с помощью изменения концентрации геля, а адсорбция белков в нем весьма мала. Полиакриламид - наиболее эффективный носитель для электрофореза белков. Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида N,N'-метилен-бис-акриламидом непосредственно в контейнере, предназначенном для проведения электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках с гелем, или на пластинках с геля.
Электрофорез в полиакриламидном геле, вероятно является наиболее гибкой и используемой электрофоретической системой для анализа и разделения молекул.
SDS -гель электрофорез
Клаус Вебер и Мери Осборн показали, что молекулярная масса многих белков можно определить с помощью измерения их подвижности в полиакриламидном геле, содержащем детергент - додецилсульфат натрия (SDS). Белки, обработанные SDS и 0,1 М меркаптоэтанолом, имеют одну и ту же форму и одинаковые отношения заряд/масса. Таким образом достигается зависимость подвижности только от молекулярной массы за счет свойств геля быть молекулярным ситом. Следовательно, если белок с неизвестной молекулярной массой подвергнуть электрофорезу с двумя белками известной молекулярной массы, неизвестная молекулярная масса может быть рассчитана с точностью от 5 до 10 %. Большая точность получается, когда неизвестная молекулярная масса находится между известными массами.
Диск электрофорез в полиакриламидном геле
Метод состоит в том, что тонкий первоначальный слой образца (1-2 мм) концентрируется в сверхтонкую стартовую зону толщиной от 1 до 100 мкм. Заметим, что находится в вертикальной колонке и представляет собой три отдельные области: верхнюю, или область образца, среднюю, называемую прокладкой, и нижнюю, состоящую из собственно разделяющего геля. Область образца и гель-прокладка имеет меньшую концентрацию (больший размер пор), чем разделяющий гель, и готовятся в буфере с низкой ионной силой и различными значениями рН. Больший размер пор верхних слоев геля означает, что молекулы в них задерживаются меньше, двигаясь при этом быстрее, чем в нижнем геле. Быстрое движение через верхние слои геля приводят к накоплению вещества на границе между прокладкой и разделяющим гелем. При движении молекул через разделяющий гель образуются различные зоны в соответствии с подвижностями. После окончания разделения гель удаляют из стеклянной трубочки. Для идентификации зон существует ряд методов. Гель можно окрашивать путем погружения в раствор красителя с последующим тщательным промыванием для удаления не связанного красителя. При необходимости гель можно фотографировать.
Диск-электрофорез применяют в основном для определения чистоты предположительно чистых белков и для анализа компонентов смесей, когда необходимо получить очень высокое разрешение (т.е. в случае присутствия очень большого количества компонентов).