МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования

В ходе исследования мы изучили штаммы микроорганизмов, выделенные от пациентов, поступивших с диагнозом ОКИ в инфекционное отделение Ивацевичской центральной районной больницы Брестской области с мая по октябрь 2011г.

Получение материала из прямой кишки с помощью ректальных тампонов (петель) осуществлялся средним медицинским персоналом. Забор материала производился трижды (в большинстве случаев): при поступлении пациента с диагнозом ОКИ в приёмном отделении и дважды в течение пребывания в стационаре.

Среды и растворы

При исследовании кишечного содержимого мы использовали такие среды как: висмут-сульфитный агар, слабощелочной и кровяной агар, среда Клиглера, среда Плоскирева.

Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом связано с некоторыми особенностями. Плотную питательную среду готовили в соответствии с инструкцией изготовителя. Важным моментом является толщина слоя агара в чашке. Она должна составлять (4,0 +/- 0,5) мм, что достигалось внесением в чашку Петри диаметром 90 мм строго 20 мл агара, диаметром 100 мм - 25 мл агара, а диаметром 150 мм - 60 мл агара. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливали на строго горизонтальную поверхность. После заполнения чашки оставляли при комнатной температуре для застывания.

Методы исследования

День первый. Идентификацию энтеробактерий начинали с изучения их колоний на пластинчатых средах. Это, в первую очередь, среда Эндо, обладающая дифференциально-диагностическими свойствами.

На среде Эндо колонии представителей семейства Enterobacteriaceae выпуклые с правильными очертаниями (круга). Они могут быть окрашены в красный цвет с наличием металлического блеска или без него (лактозоположительные энтеробактерии), бесцветными (лактозоотрицательные), могут приобретать розоватый или сероватый оттенок с более или менее выраженным темным центром, особенно у более крупных колоний. Диаметр и окраска колоний могут варьировать не только в зависимости от родовой принадлежности, но и от массивности роста. В среднем диаметр колоний составляет 1-2 мм. Шигеллы, сальмонеллы образуют более "нежные" колонии небольших размеров.

Намеченные для дальнейшего изучения колонии снимали бактериологической петлей (или иглой) и засевали штрихом по косяку и уколом в столбик комбинированной среды для первичной идентификации. Наиболее принятой в микробиологической лаборатории Ивацевичской ЦРБ является среда Клиглера.

Эта среда позволяет после 20-часовой инкубации их при 37°С составить предварительное заключение о возможной родовой принадлежности выделенных культур и определить набор необходимых тестов для идентификации рода и вида.

День второй. Производили учет результатов посева в среду для первичной идентификации.

Проводили микроскопию окрашенных по Граму мазков.

Микробы семейства Enterobacteriaceae дают на поверхности скошенной части среды Клиглера влажный, однородный, опалесцирующий рост без пигментообразования.

Ферментация глюкозы – облигатное свойство всех энтеробактерий. Проявляется в изменении окраски столбика среды (цвет зависит от используемого в среде индикатора, а также интенсивности кислотообразования).

Неизменная окраска столбика среды, не содержащей мочевины (среда Клиглера), свидетельствует о выделении микробов, не относящихся к семейству Enterobacteriaceae.

Кроме кислотообразования, по наличию разрывов (отслаиванию среды от стенок или дна пробирки) в столбике комбинированной среды судили об образовании при ферментации глюкозы газообразных продуктов (газообразование характерно для большинства эшерихий, подавляющего большинства сальмонелл).

Почернение среды, появляющееся в средней или нижней части столбика, происходит при образовании выделенным микробом сероводорода, что свойственно, представителям рода Salmonella.

Способность ферментировать лактозу (а в трех-сахарной среде и сахарозу) оценивали по изменению окраски скошенной части комбинированной среды. Обычно лактозоположительными бывают представители родов Escherichia. Ферментация лактозы нередко коррелирует с ферментацией сахароз. В неясных случаях проверяли эти свойства путем посева культур в среды Гисса с соответствующими углеводами. Таким образом, через 18-20 часов инкубации посева в комбинированную среду и одновременно в среду с мочевиной был возможен учет 4-5 признаков, характеризующих выделенную культуру, что позволяет значительно сузить диапазон подозреваемых родовых групп.

Сходное сочетание биохимических реакций (отношение к лактозе, глюкозе, мочевине, образование сероводорода) может наблюдаться одновременно у нескольких родовых групп семейства Enterobacteriaceae, и для их дифференциации использовали дополнительные тесты, минимально необходимые для установления родовой и видовой принадлежности. В таблицах 3 и 4 представлены тесты, наиболее остро необходимые и доступные.

Второй день завершали посевами на среды минимального дифференцирующего ряда и скошенный питательный агар. Для большей четкости и надежности результатов учитывали следующее:

1. при "скашивании" среды Кристенсена с мочевиной высота столбика должна превышать длину скошенной части. Посев делали штрихом по скошенной части. Окончательный учет производили через 18-24 часа;

2. для определения индола использовали индикаторные бумажки, пропитанные реактивом Эрлиха;

3. при испытании подвижности культуры в полужидком агаре делали укол петлей на глубину 1-1,5 см, а не до дна пробирки;

4. при выделении лактозоотрицательных, безгазовых культур, не образующих сероводород и не гидролизующих мочевину, к числу дополнительных родовых тестов добавляли ацетатный (или цитратный по Кристенсену) для более надежной дифференциации шигелл (не растущих на ацетатной среде и цитратной среде Кристенсена) от эшерихий, вырастающих обычно на первые, иногда вторые сутки.

День третий. Проводили регистрацию результатов испытываемой культуры в минимальном ряду тестов. В соответствии с таблицей 3 делали заключение о родовой принадлежности выделенной культуры.

РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Количество случаев ОКИ, вызванных бактериями кишечной группы семейства Enterobacteriaceae