Задание 3. Определение изоэлектрической точки белка




Практическое занятие №1

«Физико-химические свойства белков. Количественные (колориметрические) методы определения концентрации белка»

Задание 1. Высаливание белков. Обратимость высаливания

Высаливание – это обратимое осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4 и др. Этот метод используется для выделения и очистки ферментов, при выделении γ - глобулиновых препаратов в медицинской практике.

Концентрированные растворы (NH4)2SO4 высаливают почти все белки. Некоторые белки, например, глобулины, выпадают уже при полунасыщении растворов сернокислым аммонием. Другие белки, например, альбумины, выпадают только при полном насыщении. Хлористый натрий и сернокислый магний осаждают глобулины при полном насыщении. Для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей, что позволяет выделять их фракционно.

Ход работы: К 0,5 мл неразбавленного яичного белка прибавить 3 мл воды. При этом образуется небольшое количество хлопьевидного осадка глобулинов. В пробирку наливают несколько капель насыщенного раствора сульфата аммония (NH4)2SO4, после чего происходит растворение выпавшего глобулина *. К 3,5 мл полученного раствора яичного белка прибавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Глобулины выпадают в осадок. Если отфильтровать этот осадок и добавить сульфат аммония (сухой) до полного насыщения, то выпадет осадок альбумина.

* Обратимость высаливания белков заключается в растворении полученного осадка при последующем разведении водой или уменьшении концентрации солей диализом.

Задание 2. Необратимые реакции осаждения белков

Осторожно!!! Работа с агрессивными жидкостями

1) Концентрированные минеральные кислоты (кроме H3PO4) вызывают необратимое осаждение белков из растворов. Это осаждение объясняется как явлениями дегидратации белковых частиц, так и рядом других причин, например, образованием солей и др. Избыток концентрированной минеральной кислоты: серной, соляной и др., за исключением азотной кислоты, растворяет выпавший осадок белка.

Ход работы: К 1 мл концентрированной азотной кислоты с помощью пипетки осторожно добавляют по стенке пробирки 1 мл раствора белка. На границе соприкосновения жидкостей появится белое кольцо денатурированного белка.

2) Белки из раствора могут осаждаться и органическими кислотами, например, трихлоруксусной CCl3COOH и сульфосалициловой C6H3(OH)(COOH)SO3H. Они являются очень чувствительными и специфическими реактивами на белок и широко применяются для осаждения белков из биологических жидкостей. Трихлоруксусная кислота в конечной концентрации 2,5-5% часто применяется для полного удаления белков из растворов.

Ход работы: В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка и добавляют в первую пробирку 3-4 капли сульфосалициловой кислоты, а во вторую пробирку 3-4 капли 8%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) СС13СООН. В обеих пробирках белок выпадает в осадок.

3) Многие органические растворители: спирты, ацетон, эфир и др. осаждают белки. Механизм их действия объясняют связыванием воды, что ведет к дегидратации белков и понижению их устойчивости в растворе.

Ход работы: В пробирку наливают 1 мл раствора белка и по стенке осторожно добавляют 0,5 мл ацетона. На границе соприкосновения двух жидкостей появится белое кольцо денатурированного белка.

 

Задание 3. Определение изоэлектрической точки белка

Белки – это вещества, содержащие большое количество кислых и основных групп, которые в растворе находятся в диссоциированном состоянии и определяют заряд белковой молекулы. Фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов в растворе. При определенном значении рН (неодинаковым для разных белков) число положительных зарядов белка сравнивается с числом отрицательных зарядов и в целом заряд белка становится практически равным нулю. Значение рН раствора, при котором белок находится в этом изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка. Растворы белка в изоэлектрической точке наименее устойчивы и выпадают в осадок.

Ход работы: Для определения изоэлектрической точки казеина необходимо приготовить следующую серию из 5 пробирок, создавая в них растворы с определенным значением рН. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Затем в каждую добавляют по 1 мл белка казеина.

Растворы     Номера пробирок
         
Количество мл
0,1 н. СНзСООН 0,1 0,2 1,0 4,0 8,0
Н2O 8,9 8,8 8,0 5,0 1,0
рН раствора 5,6 5,3 4,7 4,1 3,8
0,4%-ный казеин в 0,1%-ном СН3СОONа 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Степень помутнения          

Наблюдают за помутнением растворов, отмечают пробирку, в которой помутнение будет наибольшим.



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2019-01-11 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: