Высокоэффективная жидкостная хроматография

РЕФЕРАТ

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией

 

	ВЫПОЛНИЛ СТУДЕНТ
	Фамилия, имя, отчество	Выползов
	Михаил Александрович
	Академическая группа	ББ-405	Курс
	Формы обучения	Очная
	«__» ______ 2019г.
	НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ
	Фамилия, имя, отчество	Варфоломеева
	Татьяна Александровна
	Ученая степень	кандидат биологических наук
	Ученое звание	Старший преподаватель
	Должность	Старший преподаватель кафедры радиационной биологии
	«__» ______ 2019г.

 

 

Челябинск

 

Содержание

Введение………………………………………………………………..

Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.Масс-спектрометрия

Жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS-MS)

Заключение

Список литературы

Введение

Жидкостная хроматография и тандемной масс-спектрометрия — широко распространённый метод химического анализа сочетающий в себе физическое разделение жидкостной хроматографии (или высокоэффективной жидкостной хроматографии) с масс-спектрометрией.

Жидкостная хроматография разделяет смеси нескольких компонентов и масс-спектрометрия обеспечивает структурную идентичность отдельных компонентов с высокой чувствительностью. Этот двойной метод может быть использован для анализа биохимических, органических и неорганических соединений часто встречается в сложных образцов из окружающей среды и биологического происхождения. Он может быть применён в широком диапазоне отраслей промышленности, включая биотехнологии, мониторинг окружающей среды, пищевой и фармацевтической, агрохимической и косметической промышленности.

Жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS-MS) является мощным аналитическим методом, который сочетает в себе разделительную способность жидкостной хроматографии с высокочувствительной и селективной возможностью масс-анализа тройной квадрупольной масс-спектрометрии.

Раствор образца, содержащий интересующие аналиты, прокачивается через неподвижную фазу (колонка LC) подвижной фазой, протекающей под высоким давлением. Химическое взаимодействие между компонентами образца, стационарной фазой и подвижной фазой влияет на различные скорости миграции через колонку LC, влияя на разделение. Широкий выбор комбинаций стационарной фазы и подвижной фазы позволяет настроить разделение в соответствии со многими сложными решениями.

После элюирования из колонки LC сточные воды направляются на масс-спектрометр. Масс-спектрометр для системы ЖХ / МС / МС имеет источник ионизации, где поток из колонки ЖХ распыляется, десольвируется и ионизируется, создавая заряженные частицы. Эти заряженные частицы затем мигрируют в высоком вакууме через серию масс-анализаторов (квадрупольных), применяя электромагнитные поля. Определенный ион-предшественник массы / заряда (или родительский ион) направлен на прохождение через первый квадруполь, исключая все другие частицы с отношением массы / заряда. В ячейке столкновения выбранные ионы массы / заряда затем разделяются на ионы-продукты (или дочерние ионы) путем столкновения с инертным газом. Третий квадруполь используется для нацеливания специфических продуктов ионных фрагментов. Полученные в результате изолированные ионы продукта затем количественно оцениваются с помощью электронного умножителя. Этот переход ионов из предшественника в продукт-ион (также называемый MS²) очень специфичен для структуры представляющего интерес соединения и, следовательно, обеспечивает высокую степень селективности.

Сила этого метода заключается в способности разделения LC для широкого спектра соединений в сочетании со способностью MS количественно определять соединения с высокой степенью чувствительности и селективности на основе уникальных переходов массы / заряда (m / z) каждое соединение интереса.

 

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC, High performance liquid chromatography) — один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, лигандообменную и другие.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное — распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

Нормально-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель:

• Гексан:изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обращённо-фазовая ВЭЖХ

Обращённо-фазовая ВЭЖХ проводится с использованием неполярной стационарной фазы и полярных (водных) растворителей. Стационарная фаза это обычный силикагель, поверхность которого была модифицирована с RMe₂SiCl, где R — прямая цепочка алкильных групп, таких как C₁₈H₃₇ или C₈H₁₇

Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия, масс-спектрография, масс-спектральный анализ, масс-спектрометрический анализ) — метод исследования вещества, основанный на определении отношения массы к заряду ионов, образующихся при ионизации представляющих интерес компонентов пробы. Способ качественной идентификации веществ, допускающий также и количественное определение. История масс-спектрометрии ведётся с основополагающих опытов Дж. Дж. Томсона в начале XX века.

Почти все масс-спектрометры — вакуумные приборы, поскольку ионы очень нестабильны в присутствии посторонних молекул. Масс-спектр — зависимость интенсивности ионного тока (количества вещества) от отношения массы к заряду (природы вещества). Поскольку масса любой молекулы складывается из масс составляющих её атомов, масс-спектр всегда дискретен, хотя при низком разрешении масс-спектрометра пики разных масс могут перекрываться или даже сливаться. Природа анализируемого вещества, особенности метода ионизации и вторичные процессы в масс-спектрометре могут влиять на масс-спектр. Так, ионы с одинаковыми отношениями массы к заряду могут оказаться в разных частях спектра и даже сделать часть его непрерывным.

Большинство небольших молекул при ионизации приобретает только один положительный или отрицательный заряд. Чем больше молекула, тем больше вероятность того, что во время ионизации она превратится в многозарядный ион. Поэтому особенно сильно данный эффект проявляется в отношении крайне больших молекул, например, белков, нуклеиновых кислот и полимеров. При некоторых видах ионизации (например, электронный удар) молекула может распадаться на несколько характерных частей, что даёт дополнительные возможности идентификации и исследования структуры неизвестных веществ.

Точное определение массы анализируемой молекулы позволяет определить её элементный состав. Масс-спектрометрия также позволяет получить важную информацию об изотопном составе анализируемых.

Заключение

Современную клинико-лабораторную диагностику нельзя представить без метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии, который позволяет диагностировать болезни. Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других. Медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человека H. pylori и является самым надёжным из всех методов диагностики. Также масс-спектрометрия применяется для определения наличия допинга в крови спортсменов.

Список литературы

1. Кишкун, А. А. Руководство по лабораторным методам диагностики [Текст] / А. А. Кишкун. — Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007. — 798 с.

2. Жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS-MS) [Электронный ресурс] https://www.eag.com/ru/techniques/mass-spec/lc-ms-ms/ (дата обращения 17. 11. 19)