Ориентировочная карта основ действий
Практического занятия
Тема: «Иммунобиологические методы исследования. Реакция агглютинации, реакция латекс-агглютинации»
План:
1. Дать понятие об иммунобиологических методах исследования:
-серодиагностика;
-сероидентификация;
-диагностические препараты: диагностические сыворотки и диагностикумы.
2. Научить учащихся подготовке посуды и ингредиентов для серологических реакций.
3. Обучить постановке ориентировочной реакции агглютинации на стекле, развернутой реакции агглютинации в пробирках.
4. Изучить реакцию латекс-агглютинации
Самостоятельная работа:
Задание № 1.
Ознакомьтесь с инструкцией для проведения практического занятия.
Задание № 2.
Изучите основные понятия темы.
Иммунобиологический или серологический метод диагностики - это метод, используемый для выявления титра (концентрации) антител в сыворотке крови (серодиагностика) и обнаружения антигенов в биологических жидкостях (сероидентификация). В основе иммунологического метода лежат серологические реакции- реакции взаимодействия между соответствующими антителами и антигенами.
Для проведения серологических реакций используют: диагностические иммунные сыворотки и диагностикумы.Иммунные сыворотки готовят из крови людей или животных, иммунизированных определенным антигеном, которые лиофилизируют и указывают их титр. Сухую сыворотку растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема.
Виды сывороток:
а) Нативные (неадсорбированные)- неспецифичны, способны давать перекрестные реакции;
б) Адсорбированные - строго специфичны - реагируют только с гомологичным антителом;
в) Агглютинирующие - используются только для реакций агглютинации;
г) Преципитирующие - используются только для реакций преципитации;
д) Моновалентные - состоят из одного вида антител;
е) Поливалентные - содержат в своем составе несколько типов антител.
В качестве диагностикумов применяют взвеси живых или убитых микробов, фракции микробных клеток, токсины бактерий.
Задание № 3.
Изучите основные требования, предъявляемые к посуде и компонентам, используемым в серологическом методе исследования.
1. Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой, стерилизация для нее необязательна.
Пробирки, пипетки не следует помещать в растворы дезинфицирующих веществ, кислот и щелочей. Стекло кипятят в простой воде, а пипетки затем просушивают этиловым спиртом и эфиром.
2. Для серологического исследования кровь (у обследуемого) берут натощак (во избежание мутноватости сыворотки, т. е. хилезности) из локтевой вены или уколом из пальца.
При взятии крови необходимо соблюдать правила асептики: 5-6 мл. крови берут в стерильную пробирку (лучше центрифужную), которую тотчас после взятия ставят на 1, 5 - 1 час в термостат при 37ºС. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенок стеклянной палочкой, после чего ставят на 18-20 часов при 4ºС (в холодильник) или центрифугируют. Полученную сыворотку переносят в другую стеклянную пробирку при помощи пипетки. Сыворотка может оставаться на сгустке не более 48 часов после взятия крови, чистая сыворотка может храниться в стерильных условиях при температуре 4 - 10ºС до 1 месяца.
Второй способ получения сыворотки крови - это центрифугирование крови в центрифуге.
3. Любая серологическая реакция ставится в определенном объеме, все компоненты, участвующие в серологических реакциях, берутся в рабочих дозах (т.е. заранее разводятся) и в равных объемах.
4. Необходимо строго соблюдать последовательность внесения ингредиентов, участвующих в серологических реакциях, а также условия, обеспечивающие взаимодействие Аг и Ат.
5. На каждый из компонентов, участвующих в серологических реакциях, ставится контроль.
6. Учет любой серологической реакции начинают с проверки достоверности результатов в контролях
7. При серодиагностике серологические реакции с сывороткой крови одного обследуемого ставят 2 раза с интервалом в 7-10 дней, в динамике должно отмечаться нарастание титра антител в положительном случае. Только тогда диагноз заболевания считается правильным.
Задание № 4.
Изучите схему постановки реакции агглютинации на стекле. Поставьте ОРА.
РА - это склеивание частиц антигена под воздействием специфических к ним антител в присутствии электролитов с образованием видимого осадка-агглютината (т.е. комплекса Аг+Ат).
Алгоритм постановки реакции агглютинации на стекле (ОРА)
1. На обезжиренное предметное стекло нанесите пипеткой 2 капли специфической адсорбированной агглютинирующей сыворотки и 1 каплю ИХН (изотонического раствора хлорида натрия).
Примечание:
а) Агглютинирующие адсорбированные сыворотки для постановки РА на стекле не, разводят, а только растворяют (если они были сухие).
б) Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:50-1:100.
в) Капли вносятся так, что бы между ними было расстояние.
2. Культуру петлей (или пипеткой) внесите в каплю физиологического раствора («КА») и в одну из капель сыворотки («0»). Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является «КС».
3.Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 минут.
Внимание!
- Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю с ИХН.
- Культуру петлей тщательно растирают на стекле на границе с каплей, а потом вносят в каплю.
Задание № 5. Учтите реакцию агглютинации на стекле.
«КС» должен оставаться прозрачным, а в «КА» должна наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешанна с сывороткой, появляются хлопья агглютинина на фоне прозрачной жидкости, то результат реакции считают положительным. Положительный результат РА свидетельствуют о гомологичности (соответствии друг другу) АГ и АТ. При отрицательном результате реакции в капле «О» будет равномерная муть, как в капле «КА», что свидетельствует о несоответствии Аг и Ат.
Примечание:
1. Реакция видна отчетливее, если ее рассматривать на темном фоне в проходящем свете.
2. При ее изучении можно пользоваться лупой.
Результат (схема):
«О» «КС» «КА»
«+» капля прозрачна равномерная муть
Результат: реакция агглютинации с поливалентной агглютинирующей эшерихиозной ОКА сывороткой положительна.
Заключение: Выделены Esсherichia coli
Задание №6. Изучите схему постановки развернутой реакций агглютинации (РРА)
| Ингредиенты, мл | Пробирки | ||||||||||
| Опытные пробирки. Разведение сыворотки | Контроли | ||||||||||
| 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | сыво- ротки | анти- гена | |||||
| Изотонический раствор, мл | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | ||||
| Сыворотка1:50, мл |  1.0
| 1.0
| 1.0
| 1.0
| 1.0 | 1.0 | - | ||||
| Диагностикум, капли | 1-2 | 1-2 | 1-2 | 1-2 | 1-2 | 1-2 | |||||
| Инкубация в термостате при t=370С. Предварительный учет через 2 часа. Окончательный – спустя 18-12 часов(при комнатной температуре) | |||||||||||
| Учет результатов | 
| 
|  
|  
|  
| прозрачна | 
| ||||
Примечание. Стрелки указывают перенос жидкости из пробирки в пробирку; из 5-й пробирки и пробирки контроля сыворотки 1,0 мл выливают в дезинфицирующий раствор.
Задание №7. Учтите результат РРА
Контроль сыворотки должен быть прозрачным, в контроле антигена должна наблюдаться равномерная муть;
В опыте, если сыворотка гомологична антигенам диагностикума, то образуется осадок в виде «зонтика», а жидкость над осадком прозрачна. Если антитела сыворотки и антигены диагностикума негомологичны, то появляется осадок в виде «пуговки». Титр сыворотки — это ее максимальное разведение, в котором еще происходит агглютинация.
Интенсивность реакции выражают следующим образом:
++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный.
+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный.
++ осадок еще меньше, жидкость мутная. Результат реакции слабо положительный.
+ незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции.
- осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции.
В приведенном примере максимальный титр равен 1:200.
Заключение: Титр сыворотки в реакции агглютинации с эшерихиозным К- диагностикумом равен 1:200
Задание №8.
Изучите принцип постановки реакции латекс - агглютинации.
Латекс-агглютинация — реакция пассивной агглютинации, при которой частицы латекса, нагруженные антигеном (белками, полисахаридами, гаптенами), агглютинируются специфическими антителами. Частицы полистирольного латекса здесь играют роль носителей антигена и являются «мостиками» между молекулами антител.
Это экспресс - метод диагностики широкого спектра заболеваний. Представлен иммунодиагностикумом на основе модифицированного полистирольного латекса, содержащего балластный белок (казеин коровьего молока) для насыщения вакантных центров связывания. Данный иммунодиагностикум характеризуется пролонгированным сроком годности и высокой чувствительностью, позволяющей проводить определения в разбавленных пробах, что препятствует возникновению неспецифической агглютинации и обеспечивает получение достоверных результатов.
Внимание: основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы.
В опытной капле к 50 мкл исследуемого материала (сыворотки обследуемого) добавляют 10 мкл латекс-препарата, сенсибилизированного антигенами.
«О» «К+» «К-»
Специфичность ЛАГ контролируют с помощью трех контрольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах: заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль.
Учет результатов: К+- агглютинация; К-- равномерная муть; ОП- агглютинация или ее отсутствие. При положительном результате реакции образуются мелкие, но хорошо видимые невооруженным глазом агглютинаты.
Перечень умений и навыков, подлежащих усвоению и закреплению на занятии:
1. Забор, доставка, регистрация, хранение и утилизация инфицированного материала
2. Проведение подготовки исследуемого материала, посуды, инструмента для микробиологического исследования
3. Соблюдение правил противопожарной безопасности в бактериологической лаборатории.
4. Соблюдение правил санитарно- гигиенического и противоэпидемического режима в бактериологической лаборатории
5.Постановка реакций агглютинации, интерпретация полученных результатов.
Вопросы для закрепления
1. Что называют серологическими свойствами бактерий?
2. С помощью каких методов выявляют эти свойства?
3. Какие серологические реакции вы знаете?
4. Расскажите о правилах сбора крови для получения сыворотки.
5.Каковы способы получения сыворотки крови?
6. Какие виды сывороток вы знаете?
7. Какие сыворотки называют моно- и поливалентными?
8. Какие сыворотки называют адсорбированными и неадсорбированными?
9. Перечислите основные компоненты для проведения ОРА.
10.Расскажите о технике проведения ОРА.
11. Как учитывают результаты ОРА?
12. Перечислите основные компоненты для проведения РРА
13. Расскажите о технике проведения РРА.
14. Как учитывают результаты РРА?
15. Перечислите основные компоненты для проведения ЛАГ.
16. Расскажите о технике проведения ЛАГ.
17. Каковы принципы учета результатов ЛАГ?
Домашнее задание: Учебник Ф.К. Черкес, с. 198-205.
Учебник С.А. Павловича,с.228-232