Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 10444.2–94. Для этого делают посев в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на агаризованные селективно-диагностические среды. Посев делают в жидкие среды, если в навеске менее 150 (15) колониеобразующих единиц (КОЕ), и на плотные среды, если в навеске (объеме) более 150 (15) КОЕ.
При содержании в 1 г твердого продукта менее 1 500 КОЕ (или в 1 см3 жидкого продукта менее 150 КОЕ) определяют наиболее вероятное число (НВЧ) посевом в жидкую селективную среду. При подозрении на наличие в 1 г (1 см3) жидкого продукта более 1500 (150) КОЕ этого вида микроорганизмов посев проводят на плотные селективно-диагностические среды.
Методы выявления и определения НВЧ S.aureus с предварительным обогащением предусматривают высев навески продукта и (или) ее разведений в жидкую селективную среду, инкубирование посевов, пересев на агаризованные селективно-диагностические среды, подтверждение по биохимическим признакам принадлежности выделенных культур к S.aureus.
Выявление и определение количества S.aureus с использованием агаризованных селективно-диагностических сред включают следующие стадии: высев навески или разведения навески продукта; инкубирование посевов; подсчет колоний с характерными для S.aureus признаками; идентификацию выделенных культур.
Из навески продукта готовят исходное и ряд 10-кратных разведений так, чтобы можно было определить в 1 г (см3) продукта предполагаемое или указанное в нормативно-технической документации количество S.aureus Степень разведения навески для посева на плотные среды выбирают такой, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке Петри, было в пределах 15–300, а в жидких средах, чтобы хотя бы в одной пробирке с наибольшим разведением отсутствовали микроорганизмы.
При определении количества S.aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см3 продукта (или его разведения) наносят на поверхность агара Байрда–Паркера, молочно-солевого, яично-желточно-азидного или яично-желточно-солевого агара в двух чашках.
При определении количества S.aureus по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбу или пробирки с одной из сред. Соотношение между количеством высеваемого продукта (или его разведения) и питательной средой 1:6 или 1:7.
Самое низкое разведение и высеваемые объемы выбирают в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов и чувствительности метода следующим образом:
по 1 см3 из разведения 10-1 и более высокого, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1 г (1 см3) продукта;
по 10 см3 из разведения 10-1 или 1 см3 неразведенного продукта и по 1 см3 из разведения 10-1 и более высокого, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10 г. (10 см3) продукта;
по 10 и 1 см3 неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 100 см3 продукта.
Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с 10 см3 питательной среды. В среду нормальной концентрации высевают 1 см3, двойной концентрации – 10 см3.
При выявлении S.aureus в определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) с предварительным обогащением эту навеску (разведение) вносят в одну из питательных сред в соотношении 1:6 или 1:7.
При анализе пищевых продуктов с высоким содержанием NaС1 проводят посев продукта (или его исходного разведения) в сахарный бульон. Во всех других случаях для посева используют солевой бульон.
При выявлении S.aureus в определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) без предварительного обогащения эту навеску (разведение) в количестве 0,1 г (или 0,2 см3) наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют в термостате при 36 ± 1°С в течение 48 ч, чашки Петри ставят дном вверх.
Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них делают пересевы петлей на поверхность одной из селективно-диагностических сред, помещают в термостат при 36±1°С на 24–48 ч и затем проводят учет.
Характерные признаки роста S.aureus на плотных средах приведены ниже.
Агар Байрда–Паркера Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5 – 2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности
Агар молочно-солевой Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности
Агар яично-желточно – азидный и яично-желточно-солевой
Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности
Колонии круглые, диаметром 2–2,5 мм, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными края ми, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет
Для подсчета количества S.aureus отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Для подтверждения наличия в продукте стафилококка отбирают не менее 5 характерных колоний и пересевают на скошенный мясопептонный агар. Через 24 ч после термостатирования при 36+1°С определяют морфологию в мазках, окрашенных по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.
S.aureus – грамположительные клетки шарообразной формы диаметром 0,6–1 мкм, располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
Способность выросших микроорганизмов образовывать каталазу определяют по методу, указанному выше. S.aureus образует каталазу. У грамположительных микроорганизмов, образующих каталазу, выявляют способность коагулировать плазму крови кролика. Для этого к плазме крови кролика добавляют по одной петле испытуемых культур, оставляя одну пробирку с разведенной плазмой незасеянной (контроль). Внесенную культуру тщательно размешивают и пробирку помещают в термостат при 36±1°С. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирку оставляют при 30+1°С на 24 ч. Если плазма не скоагулировала, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной. Реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной и в случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки либо появляются единичные нити (реакцию оценивают одним плюсом).
Реакцию считают положительной, если в плазме образовался небольшой компактный сгусток (два плюса); большой уплотненный сгусток (три плюса); плазма вся скоагулировала, сгусток не меняет своего положения при перевертывании пробирки (четыре плюса).
Для ускорения выявления коагулазоположительных стафилококков вместо агаровых культур допускается применять культуру, выращенную на мясопептонном бульоне. Ее используют для постановки реакции плазмокоагуляции спустя 2 ч после появления видимых признаков роста микроорганизмов. К 0,5 см3 разведенной плазмы добавляют 2 капли суточной бульонной культуры, учет результатов проводят в сроки от 30 мин до 2–4 ч. Реакцию оценивают плюсами (от одного до четырех).
Способность ферментировать мальтозу в анаэробных условиях определяют с целью дифференциации S.aureus от других коагулазоположительных видов – S. intermedius и S. hyicus subsp. hyicus (S.aureus ферментирует мальтозу в анаэробных условиях, S. intermedius ферментирует ее слабо, S. hyicus subsp. hyicus не ферментирует). Культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. На поверхность среды наслаивают голодный агар высотой 2–2,5 см. Посевы инкубируют при 36±1°С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в анаэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменится.
Если в посевах обнаружены грамположительные кокки, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу, ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то выявленные микроорганизмы относят к S.aureus.
При определении потенциальной энтеротоксичности выделенных культур S.aureus устанавливают их способность образовывать термостабильную нуклеазу. Для этого в среде с ДНК, разлитой в чашки Петри, вырезают асептически «колодцы» диаметром не более 4 мм, на расстоянии не менее 7–8 мм друг от друга. Культуры,
выросшие на мясопептонном бульоне после инкубирования при 36±1°С в течение 24 ч, прогревают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и вносят по 1–2 капли в «колодцы» пастеровской пипеткой. Засеянные чашки помещают в термостат при 36±1°С, результаты учитывают через 1,2 и 5 ч. При наличии термостабильной нуклеазы вокруг «колодцев» появляется ярко-розовая зона на синем фоне среды.
При окончательном анализе результатов бактериологического исследования на определенный вид (семейство, род) по ГОСТ 26670–91 надо учитывать следующее. Если при подтверждении характерных колоний обнаружено, что не менее 80% (т.е. не менее 4 из 5) из них принадлежат к S.aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к выявленным микроорганизмам. В остальных случаях количество выявляемых микроорганизмов определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных, взятых для подтверждения. Если при подтверждении колоний, полученных при пересеве с жидкой питательной среды, хотя бы в одной из 5 пробирок обнаружены выявляемые микроорганизмы, то такие пробирки с посевами считают положительными.
При определении общей бактериальной обсемененности продукта подсчитывают колонии в посевах на чашках Петри, где их выросло от 15 до 300, и вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний во всех посевах одного разведения.
Если число колоний составляет от 15 до 300 в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений, то вычисляют среднее арифметическое количество микроорганизмов по каждому из них отдельно. Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 раза, то оценку проводят по результатам посева наибольшего разведения.
Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний превышает 300, эти результаты используют для подсчета среднеарифметического значения. При числе колоний в параллельных посевах меньше 15 допускается определять суммарное число колоний и результат использовать для дальнейших расчетов. При этом количество инокулята т будет равно суммарному его количеству в параллельных посевах.
Полученные среднеарифметические значения округляют:
до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;
до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;
до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.
Количество микроорганизмов в 1 г (1 см3) продукта
M=N/m*C
где N – степень разведения навески; т – количество инокулята, внесенное на чашку Петри, см3; С – округленное среднеарифметическое значение числа колоний.
Результат определения выражают числом от 1,0 до 9,9 • 10n.
Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри в посевах одного разведения (или число подтвержденных колоний), меньше 15 (5), результаты выражают следующим образом: количество определяемых микроорганизмов в 1 г (см3) продукта меньше 15 (5), умноженное на N/т.
Допускается для приблизительного подсчета учитывать рост на чашках Петри, число колоний на которых меньше 15 (5). Доверительные интервалы для таких случаев указаны ниже.
Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует или при подтверждении микроорганизмы определенных семейств, родов или видов не обнаружены, то результат выражают как количество определяемых микроорганизмов в 1 г (1 см3) продукта меньше 1, умноженное на значение N/m.
Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 300 (150), то результат выражают следующим образом: количество определяемых микроорганизмов в 1 г (1 см3) продукта больше 150 или 300, или 50, умноженное на значение К/т.
Результаты выявления микроорганизмов в определенной навеске (объеме или площади поверхности) выражают с указанием величины навески следующим образом: микроорганизмы обнаружены или микроорганизмы не обнаружены.
Наиболее вероятное число (НВЧ) стафилококков в 1 г (1 см3) продукта определяют по ГОСТ 26670–91, исходя из количества положительных проб (пробирок) с посевами, т.е. тех, в которых обнаружен рост. Для этого выбирают три самых высоких последовательных разведения, в первом из которых все три пробирки являются положительными, а в последнем (или последующем неоцениваемом) – отрицательными (например, 4, 2, 0 или 3, 2, 1, 0). Если после разведения, в котором все три пробирки были отрицательными, одна из пробирок большего (т.е. следующего за ним) разведения окажется положительной (например, 3, 2, 0, 1), то для определения НВЧ учитывают три наивысших разведения, начиная с того, в котором количество положительных пробирок было меньше трех (т.е. 2,0,1).
Категория 1 – наиболее часто встречаемые комбинации положительных проб (пробирок), которые могут быть получены в 95%случаев. Рассчитанное НВЧ отвечает действительному числу определяемых в продукте микроорганизмов в пределах точности метода.
Категория 2 – менее вероятные комбинации положительных проб (пробирок), встречаемые в 4% случаев. Рассчитанное НВЧ может отличаться от действительного разброса, превышающего данную точность метода, но приемлемого в практике.
Категория 3 или 0 – неприемлемые комбинации положительных проб (пробирок), вероятность получения которых для нормальных продуктов равна нулю для категории 0 либо маловероятна для категории 3.
Эти категории дают часто результаты, отличающиеся от действительного числа в разбросе, значительно превышающем точность метода, и поэтому для расчета НВЧ неприемлемы.
С увеличением числа анализируемых проб от одной и той же партии продукта точность НВЧ повышается на одну, иногда на две категории. Для определения НВЧ учитывают три наивысших разведения, начиная с того, в котором количество положительных проб (пробирок) было меньше трех (т.е. 2, 0, 1).
Если после наивысшего разведения с тремя положительными пробами (пробирками) было посеяно лишь одно большое разведение, в котором оказались положительными одна или две пробы, то НВЧ микроорганизмов записывают как «более чем», так как в более высоких разведениях некоторые пробы могли бы оказаться положительными. Например, если при посеве продукта число положительных проб соответствовало трехчлену 3, 3, 1 или 3, 3, 2, то НВЧ будет больше 460 или 1100.
Если все пробы (пробирки) посеянных разведений окажутся отрицательными (т.е. 0, 0, 0), то НВЧ микроорганизмов ниже числа, выявляемого посеянными разведениями (например, ниже чем 3 в 10 г.). Наоборот, если все пробы посеянных разведений окажутся положительными (т.е. 3, 3, 3), то НВЧ микроорганизмов будет выше его максимального значения, определяемого посеянными разведениями (например, выше чем 1100 в 1 г).
При необходимости определения конечного числа микроорганизмов исследование повторяют.
Если три 10-кратных разведения были более низкими (или более высокими) по сравнению с приведенными в табл. 26, то НВЧ микроорганизмов в пробе будет на столько разрядов ниже (или выше), на сколько разрядов ниже (или выше) разведения, которые применялись для подсчета. Например, 10 см3 основного разведения (или 1 см3 переразведенной пробы) представляют собой разведение на один разряд ниже, а 10 см3 неразведенной пробы – на два разряда ниже. Так, при комбинации 3, 2, 1 НВЧ составляет 150 микроорганизмов в 1 г (1 см3) в случае, если инокулированы по 1 см3 разведения 10-1, 10-2, 10-3. Если инокулированы разведения 10-2, 10-3, 10-4, то найденное НВЧ равно 150 • 10 = 1500 микроорганизмов в 1 г (1 см3). Если инокулировано по 10 и 1 см3 неразведенного продукта и 1 см3 разведения 10-1, то НВЧ равно 150: 100 = 1,5 в 1 г (1 см3), или 15 микроорганизмов в 10 г. (10 см3) продукта.
Из значений НВЧ учитывают те, которые отвечают наиболее вероятным комбинациям трехзначного числа категории 1. Если НВЧ, соответствующее комбинации трехзначного числа категории 1, не получено, то его определяют комбинациями трехзначного числа, соответствующего категории 2.
Окончательный результат определения НВЧ вычисляют по формуле
М=N/ т*C
и выражают числом от 1,0 до 9,9 • 10n. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
При определении НВЧ S. aureus результаты посевов на жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении характерных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной из них будет обнаружен S. aureus НВЧ S. aureus в 1 г (1 см3) продукта подсчитывают по количеству положительных посевов, как указано выше. При выявлении S. aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными (т.е. S. aureus выявлен в анализируемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении характерных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной из них будет обнаружен S. aureus.
Результаты посевов на агаризованные селективно-диагностические среды: при выявлении S. aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными, если при подтверждении характерных колоний хотя бы в одной будет обнаружен S. aureus; при определении количества S. aureus в 1 г (1 см3) продукта подсчет числа характерных колоний подлежит корректировке в зависимости от результатов подтверждения принадлежности этих колоний к S. aureus.
Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев (не менее чем в 4 из 5) подтвержден рост S. aureus, то считают, что все характерные колонии принадлежат к S. aureus. В остальных случаях количество характерных колоний, принадлежащих к S. aureus, определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему числу характерных колоний, взятых для подтверждения.
Результаты определения количества S. aureus в 1 г (1 см3) продукта и выявления его в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670–91 от 1 до 9,9 • 10n.
Профилактика пищевых отравленийдолжна основываться на следующих общих положениях:
1. предупреждать обсеменение продуктов микроорганизмами;
2. предупреждать размножение микробов в продуктах (соблюдать температурные режимы и сроки хранения);
3. уничтожать микробов в продукте тепловой обработкой.
Источником обсеменения пищевых продуктов патогенными стафилококками могут быть люди с гнойничковыми поражениями кожи, имеющие контакт с продуктами питания, а также больные ангиной. Кроме того, представляет опасность молоко, полученное от коров, больных маститом.
Профилактика пищевых интоксикаций стафилококковой этиологии сводится к предотвращению обсеменения продуктов патогенными стафилококками, размножению их, а также к уничтожению возбудителя в продуктах питания. К работе на пищевых предприятиях нельзя допускать людей, больных ангиной и с гнойничковыми заболеваниями (фурункулы, абсцессы, нагноившиеся раны, царапины). Необходимо строго соблюдать технологические режимы тепловой обработки продуктов и сроки хранения готовой продукции.
Нельзя допускать нарушений сроков реализации товара.
Список литературы
1. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В., Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. - М.: 2006.–407 с.
2. Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. и др. Под ред. Любашенкои С.Я. Санитарная микробиология. - М.: Пищевая пром-сть, 1980. – 352 с.
3. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Лира, 2002. – 413 с.
4. Загаевский И.С. Жмурко Т.В. «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства». М.: Колос. 1983.
5. Макаров В.А. и др. «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства». М.: Агропромиздат. 1991.
6. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Пищевая промышленность, 1980. - 256 с.
7. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы (САНПиН 2.3.2.560–96). – М., 1997.
8. М.А. Сидоров, Р.П. Корнелаева «Микробиология мяса и мясопродуктов» 3-е издание. Москва «Колос» 1998–134 стр.