Иммунофлуоресценция и иммуноцитохимия (ИФА и ИЦХА соответственно) - методы, применяемые в клинической патологии человека.
Для иллюстрации мы воспользовались собственными примерами иммунофлуоресцентного и иммуноцитохимического анализа мононуклерных субпопуляций при клинических исследованиях иммунофенотипа лейкемий у детей. Каждый из последовательно описанных здесь методов являются как бы ступенью к более полной оценке клеточных фенотипов.
В современном ИФА используются микроскопы с освещением препарата сверху и комплекты селективных светофильтров для регистрации зеленой флуоресценции изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ) и красной флуоресценции изотиоцианат тетраметилродамина (ТРИТЦ). Тот же комплект светофильтров позволяет одновременно наблюдать оранжевое свечение еще одного флуорохрома, фикоэритрина (ФЭ). Флуоресцентномикроскопическое исследование мембранных и цитоплазматических маркеров клетки, как правило, сочетается с цитологическим анализом при помощи фазовоконтрастной оптики, позволяющей исследователю отличить типичные лимфоциты от гранулоцитов, моноцитов, больших гранулярных лимфоцитов и лимфобластов. Фазовоконтрастная микроскопия клеток может иметь самостоятельное значение для цитологической диагностики, а флуоресцентная микроскопия помимо визуального выявления флуоресцирующих мембранных и цитоплазматических маркеров может служить методом предварительной оценки клеточных взвесей перед количественной проточной цитофлуориметрией.
ИЦХА так же, как и ИФА, довольно часто используется в цитологической диагностике и в исследовательской работе. Методы исследования на основе ИЦХА и ИФА взаимно дополняют друг друга и во многих лабораториях в зависимости от характера исследуемых проблем применяются и те и другие методы.
Иммунофлуоресцентное маркирование клеток
в пробирках для микротитрования (микропанельный ИФА).
Специфические моноклональные антитела (МКА) связываются с мембранными антигенами живых клеток, находящихся в суспензии. Чтобы предотвратить кэппинг и шеддинг (слущивание) антигенов после взаимодействия с антителами, к суспензии клеток добавляют 0,2% азида натрия. В прямых методах ИФА используют специфические к клеточным антитенам антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой, и маркирование клеток производят как одноэтапную реакцию. В непрямых методах ИФА в качестве первых антител используют немеченые антитела к клеточным антигенам, а в качестве вторых - меченные флуорохромом антитела к иммуноглобулинам. Маркирование клеток производят в два этапа. Вторые антитела служат для выявления связанных с клеткой первых антител. Непрямые методы обычно чувствительнее прямых.
Использование предназначенных для микротитрования пластиковых микропробирок позволяет одновременно производить ИФА значительного числа образцов клеток, применяя многочисленные образцы МКА. Перенесенные на каждое стекло 8-12 капель клеточных взвесей в глицериновом буфере оседают на поли-L-лизин и исследуют под микроскопом. Используют фазовоконтрастный объектив с просветленной оптикой, увеличением 63х и числовой аппертурой 1,3-1,4, безупречно скорригированной изготовителем.
Микропанельный ИФА специально предназначен для исследования антигенов лимфоцитарных мембран и диагностики лейкемий. Однако в связи с тем, что он гораздо экономичнее других модификаций ИФА по расходу реагентов, исследуемых клеток и времени, его можно приспособить для решения других экспериментальных задач особенно в тех случаях, когда требуется исследовать одновременно много образцов суспензий, содержащих ограниченное число клеток.
Распределение флуоресцентных меток на клеточной мембране весьма тонко характеризует ее морфологию. Присутствие азида предотвращает кэппинг и шединг антигенов, но движения мембраны, например образование пэтчей, все же происходит, и благодаря им удается идентифицировать клетки по цитологическим различиям распределения маркера. Так, образование пэтчей отличается от появления "гранулярных" скоплений метки в результате связывания иммунных комплексов* с Fc-рецепторами. Гомогенное же распределение метки по клеточной мембране свойственно нефиксированным погибшим клеткам, связывающим меченые антитела неспецифически.
(Cледует пунктуально производить процедуру отмывания клеток (т.е.
число ресуспендирований и осаждений), так как следовые количества МКА
в надосадочной жидкости могут прореагировать с антителами к
иммуноглобулинам с образованием растворимых комплексов,
которые будут связываться с Fc-рецепторами клеток, на самом деле не
экспрессирующих выявляемый антиген)
Набор образцов МКА, предназначенный для диагностики лейкозов состоит из реагентов, специфичных к дифференцировочным антигенам стволовых гемопоэтических клеток, клеток миелоидного ряда, а также Т- и В-клеток. Чтобы установить принадлежность лейкозных клеток к определенному гемопоэтическому ростку и идентифицировать ту стадию дифференцировки, на которой прекратилось их созревание, нужно располагать целым набором МКА, обеспечивающих надежное фенотипирование клеточноспецифических антигенов. Вместе с тем, система идентификации клеток должна обладать известной широтой, чтобы выявлять разнообразные отклонения исследуемых клеток от нормальной постадийной динамики антигенного фенотипа. Результатом таких отклонений иногда могут быть идиосинкратические фенотипы лейкозных клеток, которые помимо этого имеют множественные хромосомные аберрации. Поэтому именно микропанельный ИФА с одновременным использованием целого набора МКА и быстрым получением разнообразной информации позволяет избежать ошибочных оценок фенотипических данных, а также дает возможность провести дополнительное иммунофенотипирование с любой новой комбинацией реагентов.
Иммуноцитохимический анализ цитологических препаратов.
Основанные на реакции антиген-антитело методы микроскопического выявления и идентификации молекулярных компонентов клеток называют иммуноцитохимическими. В качестве реагентов для выявления клеточных антигенов в большинстве случаев используют специфические МКА, которые после связывания с антигеном устанавливают прямым или непрямым методом по метке. Меткой служат конъюгированные с антителами ферменты или флуорохромы. Как уже указывалось выше, непрямой метод обнаружения клеточных антигенов, основанный на использовании вторых антител, чувствительнее прямого. Используя аффинные взаимодействия типа фермент-антитела к нему или комплекс биотина, конъюгированного с ферментом авидином, можно достичь еще большего увеличения чувствительности. При постановке иммуноцитохимических методов требуется прежде всего так фиксировать исследуемый клеточный материал, чтобы в клетках сохранялась нативность выявляемых антигенов.
Пероксидаза хрена (ПХ) в присутствии небольшого количества перекиси водорода катализирует окисление 3,3'-диаминобензидина (ДАБ) с образованием нерастворимого золотисто-коричневого продукта. Если ПХ непосредственно или опосредовано присоединить к антителам, то эта реакция может происходить лищь там, где меченные ферментом антитела связались с антигеном.
При микроскопии окрашенных препаратов на фоне обычной цитологической картины, например костного мозга, можно идентифицировать коричневый продукт ферментативной реакции, образовавшийся в местах связывания использованных антител с выявляемыми антигенами.
Иммуноферментное маркирование можно осуществлять при помощи комплекса щелочная фосфатаза-антитела к щелочной фосфатазе (ЩФ-АЩФ). Принцип маркирования тот же самый, что и при использовании иммунопероксидазной метки. Конечный продукт ферментативной реакции имеет хорошо заметный красивый красный цвет.
Результаты микроскопического исследования препаратов, маркированных ЩФ, интерпретируют таким же образом, как и при маркировании пероксидазой. Использование комплексов ЩФ-АЩФ, особенно при повторных циклах нанесения, повышает чувствительность иммуноферментного анализа до уровня иммунофлуоресцентного и выше. Причины слабого окрашивания определенных антигенов при использовании того или другого иммуноцитохимического метода не всегда понятны. Следует отметить, что можно достичь оптимального выявления различных клеточных антигенов, применяя в одних случаях комплексы ЩФ-АЩФ, а в других ИФА.
При использовании флуоресцентной метки можно различить поверхностную и цитоплазматическую локализацию выявляемых антигенов. Ферментные метки этого не позволяют. В некоторых случаях суспендированные клетки можно проинкубировать с МКА, конъюгированными с ферментом, приготовить из взвеси мазки и определить затем локализацию антител с помощью соответствующего субстрата. При этом возможно выявление некоторых поверхностных антигенов.
Преимущества и недостатки разных методов выявления клеточных антигенов, в том числе авидин-биотинового и стрептавидин-биотинового, подробно описаны в специальных руководствах.
Двойное маркирование клеток.
Цель двойного маркирования - это выявление двух различных антигенов на одной клетке. Для его осуществления можно воспользоваться двумя образцами флуорохромированных первых антител, например конъюгированными с ФИТЦ козьими антителами к c-цепям и конъюгированными с ТРИТЦ козьими антителами к l-цепям человека, или двумя образцами мышиных моноклональных антител разного изотипа, которые затем выявляются вторыми класс- и субкласс-специфическими антителами к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированными с разными флуорохромами.
Интерпретация результатов двойного иммунофлуоресцентного маркирования не вызывает затруднений. Поочередно используя комплекты светофильтров для ФИТЦ и ТРИТЦ, можно определить, маркирована ли данная клетка антителами одной или двух специфичностей. В то же время интерпретация результатов двойного иммуноферментного маркирования не столь проста. Клетки, меченные пероксидазой, приобретут золотисто-коричневую окраску, а меченные щелочной фосфатазой - голубую (диазоль синий вместо диазоля красного). Обе метки одновременно окрашивают клетку в розовато-лиловый цвет. Вместе с тем клетка имеющая оба антигена может быть ошибочно отнесена к обладающим лишь одним антигеном из-за того, что какой-либо из них экспрессирован с гораздо большей плотностью, чем другой.
В заключение следует отметить, что двойное маркирование с обязательным контролем специфичности реагентов, используемых в непрямом двухцветном ИФА, позволяет выявлять уникальные фенотипические характеристики клеток в норме и при патологии. Результаты такого анализа можно использовать при выделении из крови, лимфы, костного мозга или тканей, интересующих исследователя, редко встречающихся клеток для функционального изучения in vitro, которое будет способствовать раскрытию взаимосвязей между функциями клеточных субпопуляций и их фенотипическими характеристиками.
ИММУНОГИСТОХИМИЯ
Иммуногистохимия (ИГХ) - это метод выявления и точной локализации того или иного клеточного или тканевого компонента (антигена) in situ с помощью иммунологических и гистохимических реакций. Авторами этого метода по праву считается группа исследователей под руководством Альберта Кунса, которые впервые получили меченные флюоресцеином антитела и применила их в диагностических целях. Более широкое распространение ИГХ получила в 70-е годы после публикации Taylor и Burns, продемонстрировавших наличие иммуноглобулинов в плазматических клетках. Последующие годы были отмечены не только совершенствованием самого метода, но и расширением сфер его применения.
Основой ИГХ является реакция антигена и антитела. В качестве антигена может выступать практически любой клеточный или тканевой компонент: структурные белки клеток, поверхностные гликопротеины лимфоцитов, рецепторы гормонов, ростовые факторы и их рецепторы, коллаген IV типа, ламинин, онкопротеины, вирусные белки и т.д.. После иммунизации лабораторного животного антигеном его В- лимфоциты начинают синтез антител, причем каждый клон В-лимфоцитов способен вырабатывать антитела лишь к одному типу эпитопов. В настоящее время используются как сыворотки иммунизированных животных, содержащие смесь антител к нескольким эпитопам, производимые многими клонами- такие антитела называют поликлональными, так и моноклональные антитела, как правило мышиные (Рис.2.4-1). Моноклональные антитела не содержат примесей, которые могут встречаться в сыворотке, и, главное, они высоко специфичны.
При встрече антигена и специфичного ему антитела происходит их связывание, задачей гистохимических реакций, которые включаются в процесс на этом этапе, является сделать продукт реакции антиген- антитело видимым для глаза. Для достижения этой цели используются метки разного типа. Флюоресцентные метки используются и сейчас, однако использование их в широкой практике ограничено. Более широкое применение получили методы ИГХ с использованием ферментных меток. Ферменты, присоединенные (конъюгированные) к антителам запускают каскад гистохимических реакций с хромогеном, приводящих, в конечном счете, к образованию некого окрашенного продукта, расположенного в местах локализации иммунного комплекса. Чаще всего таким ферментом-маркером служит пероксидаза хрена, которую впервые применили для целей ИГХ Накане и Пирс. В качестве хромогена, с которым вступает в реакцию пероксидаза, широко используется ДАВ. Полученные препараты стабильны и могут длительно храниться, они доступны для просмотра в обычном светооптическом микроскопе. Применяются также и другие ферментные метки- щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т.д., которые требуют использования соответствующих хромогенов.
Все иммуногистохимические техники можно разделить на 2 группы: методы с меченными и немечеными антителами, отличающиеся по степени чувствительности. Чувствительность метода определяется количеством молекул пероксидазы, участвующих в реагировании. Наиболее чувствительным в настоящее время следует признать авидин-биотиновый метод и его разновидности.
Можно выделить следующие основные сферы применения ИГХ в диагностической практике:
1. Диагностика опухолей неясного генеза.
Обычное гистологическое исследование не всегда может ответить на вопрос о происхождении (гистогенезе) опухоли. Во многих подобных случаях правильно подобранная панель антител может помочь установить правильный диагноз. При ИГХ диагностике опухолей можно использовать алгоритм, предложенный D. Mason(1987).
Опухоль, экспрессирующая цитокератины или Антиген эпителиальных мембран (ЕМА), имеет эпителиальное происхождение, либо содержит эпителиальный компонент. Цитокератины-- это группа водо-растворимых внутриклеточных пептидов, присутствующих практически во всех эпителиальных клетках. По молекулярному весу все цитокератины могут быть подразделены на низко- и высокомолекулярные, которые также различаются по порядковым номерам. Каждый вид эпителия экспрессирует свой специфический набор кератинов, обычно от 2 до 10. Состав этого набора зависит не только от вида эпителия, но также от стадии эмбрионального развития, клеточного окружения, а в случае рака и от степени дифференцировки. Существует множество антител к цитокератинам, но в обычной диагностической практике используют анти-панцитокератин, пригодный для выявления большинства раков. В таблице 2.4-1 представлены результаты тестирования антител к панцитокератину, проведенного на большом количестве опухолей разного гистогенеза. Наличие в группе кератин-позитивных опухолей ряда опухолей неэпителиального происхождения обусловлено тем, что мезенхимальные клетки обладают возможностью экспрессировать кератины в норме на определенных этапах филогенеза, а также транзиторно при опухолевой трансформации. Кроме цитокератинов, для диагностики эпителиальных опухолей используется также антиген эпителиальных мембран (ЕМА), гликопротеин, присутствующий во многих эпителиальных клетках. Данное антитело обладает меньшей специфичностью, чем цитокератины, однако может заменить его в ситуации, если активность кератинов была уничтожена вследствие неоптимальной фиксации. Необходимо помнить о том, что экспрессия ЕМА отмечается в ряде опухолей лимфоидного происхождения высокой степени злокачественности. Экспрессия опухолью Общелейкоцитарного антигена (LCA) говорит о ее гемопоэтическом происхождении. LCA- это высокомолекулярный гликопротеин, который содержится в большом количестве в наружных клеточных мембранах практически всех клеток лимфоидного и костномозгового происхождения. Экспрессия этого антигена не отмечена в нормальных или опухолевых клетках другого происхождения, поэтому данный антиген является важным дискриминирующим фактором, особенно, при проведении дифференциального диагноза между недифференцированным раком, амеланотической меланомой и крупноклеточной лимфомой.
Белок S-100 - это растворимый белок, выделенный из ткани головного мозга, и, как первоначально предполагалось, специфический маркер глиальных клеток. В настоящее время имеются данные об экспрессии белка S-100 меланоцитами, клетками Лангерганса, гистиоцитами, хондроцитами, липоцитами, скелетными и сердечными мышечными клетками, Шванновскими клетками, эпителием и миоэпителием молочных, слюнных и потовых желез, и, соответственно, опухолями из указанных клеток. Наибольшее распространение белок S-100 имеет для диагностики меланом, однако, учитывая широкий характер экспрессии этого антигена его надо применять только в панели с другими антителами. Еще одним антигеном, пригодным для подтверждения меланомы, служит меланомо-специфический антиген (HMB-45), находящийся в премеланосомах. ИГХ диагноз амеланотической меланомы можно сформулировать, как опухоли негативной к кератинам и LCA, но позитивной к S-100, HMB-45 и виментину.
Десмин- это промежуточный филамент гладко,- поперечно- полосатых и сердечных мышечных клеток. Синтез десмина начинается в ранний период дифференцировки миобласта и предшествует появлению других структурных белков, например, миоглобина. Десмин используется для верификации опухолей мышечного генеза, таких как лейо- и рабдомиосаркомы. Актин- это сократительный белок, который имеет 6 изоформ, из которых a- форма присутствует только в мышечных клетках, тогда как другие присутствуют в клетках не- мышечного происхождения. Использование моноклональных антител к a- форме актина позволяет отдифференцировать миогенные опухоли.
Нейрогенные и близкие им по гистогенезу опухоли экспрессируют целый ряд антигенов, которые используются для диагностики. Среди них нейрофиламент - промежуточный филамент нейронов, нейрон- специфическая энолаза, синаптофизин. Нейрон-специфическая энолаза - это один из изоэнзимов энолазы, состоящий из 2(единиц. Она содержится в большом количестве в нейронах и клетках нейроэндокринного происхождения. Синаптофизин, белок пресинаптических пузырьков нейронов, также является чувствительным маркером невральной и нейроэндокринной дифференцировки. Опухоли чисто нейрогенного происхождения экспрессируют все или часть из перечисленных маркеров, но негативны к цитокератину. Если же опухоль дополнительно экспрессирует цитокератин, то это свидетельствует в пользу нейроэндокринной природы. Примером такого рода опухолей может служить нейроэндокринный рак кожи или опухоль Меркеля, карциноиды. В качестве дополнительного маркера в подобных случаях можно использовать антитела к хромогранину А- члену семьи родственных белков, входящих в состав матрикса нейросекреторных гранул, а также присутствующего практически в клетках всех эндокринных желез. Глиальные клетки синтезируют глиальный фибриллярный кислый белок.
Виментин -это промежуточный филамент, который экспрессируется большинством клеток мезенхимального происхождения. Первоначальные исследования давали возможность предположить, что виментин является специфическим маркером и позволит проводить дифференциальный диагноз между опухолями не-эпителиального и эпителиального генеза. Более поздние данные указывают, что экспрессия виментина не имеет рестрикции к опухолям из клеток мезенхимального происхождения, но также закономерно встречается в раках, меланомах. Эпителиальные клетки могут экспрессировать виментин при культивировании in vitro, a in vivo этот феномен отмечается у раковых клеток, находящихся в экссудатах. Таким образом, экспрессия виментина как единственного маркера имеет небольшое диагностическое значение, но при использовании его в панели с другими антителами и в соответствующем гистологическом контексте, он может стать дискриминирующим фактором.
Следует отметить, что в настоящее время существует очень ограниченное количество органо-специфических антител, из которых можно упомянуть антитела к простата-специфическому антигену, простатической кислой фосфатазе, тиреоглобулину. Применение этих антител может помочь при решении вопроса о источнике метастаза.
Страница 161 
2.Определение клональности.
К сожалению, возможности ИГХ для решения задач такого типа не велики, т.к. в настоящее время иммуногистохимические маркеры клональности для большинства опухолей неизвестны. Однако, существует надежный тест определения клональности В-лимфоцитов и плазматических клеток. Как известно, каждый лимфоцит/ плазмоцит может кодировать и экспрессировать один из типов легких цепей- каппа или лямбда и в норме в лимфузлах могут обнаружены клетки обоих типов в соотношении k(каппа):l(лямбда)=2:1, т.е. популяция в норме поликлональна. В случае опухолевой трансформации, отмечается рост клеток одного из типов при вытеснении, а позднее и полном исчезновении клеток другого типа, т.е. популяция становится моноклональной. Т.о. окрашивание с антителами к легким цепям может быть использовано для дифференциального диагноза между реактивной гиперплазией лимфузла и начальными стадиями фолликулярной лимфомы (по экспрессии поверхностных Ig лимфоцитами) или реактивного плазмоцитоза и миеломы (по экспрессии цитоплазматических Ig плазматическими клетками).
3. Обнаружение небольшого количества клеток.
Подобная необходимость возникает при исключении микрометастазирования в лимфузлах и костном мозге. Кроме того, ИГХ используется для быстрого выявления клеток Штернберга при лимфогранулематозе (ЛГР),при диагностике вирусных поражений.
4. Окрашивание стромальных тканевых компонентов.
В настоящее время имеется ряд антител, которые окрашивают основные структурные белки базальных мембран и соединительной ткани, эндотелий сосудов. Данные антитела используются в разнообразных ситуациях. Так, окрашивание с антителами к компонентам базальных мембран коллагеном IV типа или ламинином, позволяет более достоверно диагностировать начальные признаки инвазивного роста. Эти же антитела позволяют оценить соотношение стромы и опухолевых клеток. Антитела к фактору VIII окрашивают эндотелий сосудов и могут быть использованы для оценки степени васкуляризации и сосудистой инвазии в опухолях. Они также окрашивают все сосудистые опухоли. По экспрессии CD21 на фолликулярных дендритических клетках можно судить о типе роста лимфом- диффузном или фолликулярном.
5. Иммунофенотипирование опухолей, особенно опухолей
лимфоидной системы. Иммунофенотипирование опухолей обычно бывает логически связанным с выявлением ее гистогенеза. Наиболее распространено иммунофенотипи-рование лимфом, при этом иммунофенотип лимфопролиферативных заболеваний обычно бывает выражен как перечень антигенов по классификации CD, которые обнаружены в конкретном случае. В настоящее время описано более 100 классов CD, однако для целей диагностики достаточно использовать панель, включающую по 2-3 антитела каждой специфичности. Возможен вариант панели антител представлен на рисунке 2.4-3. Для диагностики гистиоцитоза из клеток Лангерганса необходимо прибавить S-100 и СD1а. Иммунофенотипический дифференциальный диагноз 2 близких по морфологии вариантов лимфом: лимфогранулематоза и анапластической крупноклеточной лимфомы представлен в таблице 2.4-2. Если фенотипирование лимфом стало уже рутинной процедурой, то типирование лейкозов в срезах сопряжено с гораздо большими трудностями, т.к. для обычно требует применения гораздо большего числа антител, в то время как реактивность антигенов большей частью утрачена. Поэтому результативность метода не всегда удовлетворительна. Панель для фенотипирования лейкозов может состоять из CD34, антител к миелопероксидазе, KP-1 (CD68), CD15- для миелоидной линии, гликофорину А - для диагностики М6, фактору VIII или гликопротеину IIa/IIIb - для диагностики М7. Для типирования лимфобластных лейкозов пригодна "лимфомная" панель.
В настоящее время особое внимание уделяется выявлению прогностических факторов, многие из которых могут быть выявлены иммуногистохимически. Так, в раках молочной железы изучают уровень экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону. Для большинства опухолей очень важным прогностическим признаком служит пролиферативная активность, которую можно изучать используя антитела к компонентам, вовлеченным в процесс репликации. Иммуногистохимически можно выявлять экспрессию онкопротеинов, рецепторов факторов роста, белков- индикаторов апоптоза и т.д. Кроме того, ИГХ может быть составляющей других методов, например, гибридизации in situ.
Рекомендуемая литература для чтения:
1. Chadburn A., Knowles D.M. Paraffin-resistant antigens detectable by antibodies L26 and polyclonal CD3 predict the B- or T-cell lineage of 95% of diffuse aggressive non-Hodgkin's lymphomas. Am J Clin Path 1994; 102:284-91.
2. Jones T.J., Coad N.A.G., Muir K.R., Parkes S.E., Evans C.D., Mann J.R. Immunophenotypic analysis of childhood Burkitt's lymphoma in West Midlands 1957-1986. J Clin Path 1995; 48:22-5.
3. Kurtin P.J., Roche P.C. Immunoperoxidase staining of non-Hodgkin's lymphomas for T-cell lineage associated antigens in paraffin sections. Comparison of the performance characteristics of four commercially available antibody preparations Am J Surg Path 1993;17;898-904.
4. Perkins S.L., Kjeldberg C.R. immunophenotyping of lymphomas and leukemias in paraffin-embedded tissues. Am J Clin Path 1993;99;362-73.
ЦИТОГЕНЕТИКА
Изменения хромосом у больных лейкозами.
Современная цитогенетика берет свое начало с 1956 года, когда Tjio и Levan установили истинное диплоидное число хромосом в клетках человека, равное 46, и описали основные морфологические характеристики хромосом. Однако ещё раньше, в начале ХХ века проводились исследования, авторы которых пытались не только определить число и форму хромосом, но и установить их роль в процессах опухолевого роста. Первый труд, обобщающий работы в этой области, был опубликован в 1914 году Boveri. Согласно его представлениям, злокачественно перерожденные клетки характеризуются аномалиями в структуре хроматина. Позднее, после публикации работ Tjio и Levan было проведено большое число исследований, посвященных изучению хромосом в опухолевых клетках.
В 1960 году был описан первый генетический маркер опухоли - филадельфийская хромосома (Ph). Она была обнаружена исследователями, работавшими в Филадельфии, Novell и Hungerford, в метафазных пластинках, полученных при культивировании клеток крови пациентов с хроническим миелолейкозом. Измененная хромосома представляла собой результат делеции примерно половины длинного плеча хромосомы 22 пары.
С тех пор значительно изменились методики приготовления препаратов хромосом, качество получаемых метафазных пластинок и техническая оснащенность цитогенетической лаборатории. Все это привело к значительному прогрессу наших знаний об изменениях хромосом у больных лейкозами и опухолями и о клиническом и прогностическом значении этих повреждений.
Среди большого разнообразия хромосомных аномалий выделяют специфические или первичные изменения кариотипа, которые характерны для определенных вариантов лейкозов и опухолей и, несомненно, имеют отношение к патогенезу данного заболевания. К первичным изменениям хромосом относят структурные поломки (транслокации, делеции, инверсии и амплификации), в которые вовлекаются онкогены, гены ростовых факторов, клеточных рецепторов и другие биологические активные гены. Перенос, активация или потеря генов, контролирующих работу онкогенов в составе нормального генома, а также образование вследствие транслокаций новых генетических последовательностей ДНК играют ключевую роль в процессах неопластической трансформации.
Кроме специфических изменений хромосом выделяют ещё неспецифические или вторичные хромосомные аберрации, которые могут появляться в результате опухолевой прогрессии и отражают процессы клоновой эволюции лейкозных клеток. Вторичные изменения хромосом не являются уникальными. Одни и те же поломки описаны при различных опухолях. Однако выявление их в кариотипе больных отражается, как правило, на течении заболевания.
Хронический миелолейкоз (взрослый тип).
Филадельфийская хромосома (Ph) обнаруживается более, чем у 90% больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) как взрослых, так и детей. Образуется она вследствие реципрокной, или сбалансированной, транслокации между хромосомами 9 и 22 пар - t(9;22)(q34;q11). При этом хромосома 9 пары повреждается в локусе q34, где локализован онкоген ABL, а 22 хромосома - в точке q11, где находится ген BCR (breakpoint cluster region). В результате транслокации на 22 хромосоме образуется новая патологическая последовательность ДНК, ген BCR-ABL, белковый продукт которого характеризуется повышенной тирозинкиназной активностью, как большинство известных онкопротеинов. Интересно, что в тех случаях, когда у больных ХМЛ обнаруживаются нетипичные хромосомные изменения или нормальный кариотип, BCR-ABL ген выявляется в клетках костного мозга и периферической крови пациентов.
Во время бластного криза у большинства больных Ph-позитивным ХМЛ выявляются дополнительные поломки хромосом. Наиболее частыми среди них являются - дополнительная филадельфийская хромосома (Ph), образование изохромосомы по длинному плечу хромосомы 17 пары (iso 17q), прибавки хромосом (трисомии) 8, 9, 19 пар, потеря одной из половых хромосом и другие более редкие дополнительные цитогенетические изменения. При благоприятном течении бластного криза и достижении больным хронической фазы обнаруживаются клетки только с Ph-хромосомой и не выявляются метафазы, несущие дополнительные хромосомные аберрации.
Острый нелимфобластный лейкоз.
В настоящее время изменения хромосом обнаруживают у большей части больных острым нелимфобластным лейкозом (ОнеЛЛ). Последние сообщения позволяют говорить, что, используя высокоразрешающую технику исследования кариотипа, патологию хромосом можно выявить у 70 - 90% больных ОнеЛЛ.
Для каждого варианта ОнеЛЛ по Франко-Американо-Британской классификации (FAB) с разной степенью специфичности характерны определенные первичные изменения хромосом (Рис.2.5-1).
Одним из наиболее частых изменений является транслокация t(8;21)(q22;q22). Она выявляется в 20% всех ОнеЛЛ и считается наиболее характерной для М2 варианта лейкоза, хотя описана и у пациентов с М1 и М4 вариантами ОнеЛЛ. Встречаемость данной патологии кариотипа у детей с М2 вариантом ОнеЛЛ составляет, в среднем, 40%. Особенности лейкозов, протекающих с t(8;21)(q22;q22), помимо частичного созревания гранулоцитарных элементов, заключаются в следующем: в лейкозных клетках обнаруживаются тельца Ауэра, вакуолизация цитоплазмы, гиперсегментация ядра, низкий уровень щелочной фосфатазы. Больные, в клетках которых обнаружена t(8;21)(q22;q22), как правило, хорошо реагируют на проводимую химиотерапию и достигают ремиссии с большей частотой, чем больные тем же вариантом лейкоза с другими цитогенетическими изменениями хромосом или с нормальным кариотипом. В частности, по данным французского кооперативного исследования (1990 год) частота достижения ремиссии у детей с транслокацией t(8;21)(q22;q22) составила 90,7%. Однако дальнейший прогноз у пациентов этой группы не столь благоприятен. Средняя продолжительность ремиссии и общая выживаемость у них, в среднем, короче, чем те же показатели у больных с другими изменениями хромосом или с нормальным кариотипом.
При молекулярном исследовании клеток с транслокацией t(8;21)(q22;q22) обнаружено, что на 8 хромосоме в точке поломки локализован ген ETO, а на 22 хромосоме - AML1 ген. Вследствие транслокации происходит обмен генетической информацией, слияние двух последовательностей ДНК и образование нового гена - AML1/ETO на делетированной 8 хромосоме. Типирование данного гена методами молекулярной генетики позволяет выявлять данную последовательность ДНК в тех ситуациях, когда цитогенетический анализ провести невозможно. Кроме того, чувствительность методов молекулярной генетики значительно выше, чем стандартного цитогенетического исследования, поэтому выявление транскриптов "химерных" генов значительно улучшает диагностику данных заболеваний.
Другой хорошо известный хромосомный маркер нелимфобластного лейкоза - транслокация t(15;17)(q24;q21). Она является высоко специфичной для М3 варианта ОнеЛЛ. На 17 хромосоме, в точке поломки при данной транслокации обнаружен ген рецептора ретиноевой кислоты (RARa). В результате транслокации он соединяется с геном PML1, который в норме расположен на хромосоме 15 пары. Образование данной патологической последовательности ДНК, нового "химерного" гена PML1\RARa является, несомненно, важным патогенетическим моментов в формировании острого промиелоцитарного лейкоза.
Для больных М4 вариантом ОнеЛЛ типичным является повреждения 16 хромосомы - делеция del(16q), перицентрическая инверсия inv(16)(q13;q22) или транслокация между двумя хромосомами 16 пары t(16;16)(q13;q22). Точка поломки 16 хромосомы совпадает с локусом локализации гена b-частицы транскрипционно-активного CBF-фактора (Core Binding Factor). Больные с такой цитогенетической поломкой характеризуются наиболее благоприятным прогнозом.
У пациентов с М5 вариантом ОнеЛЛ достаточно часто в клетках костного мозга или крови обнаруживается повреждение длинного плеча хромосомы 11 пары, чаще - транслокация t(9;11)(p21;q23) или делеция del(11)(q23). Для пациентов с такой патологией кариотипа характерны следующие клинические особенности: молодой возраст пациентов, высокий лейкоцитоз в периферической крови и неблагоприятный прогноз. По данным молекулярных исследований в результате подобных цитогенетических перестроек происходит повреждение гена MLL (ALL1), локализованного на длинном плече 11 хромосомы (11q23).
У больных с эритролейкемией не обнаружены какие-либо строго специфические изменения кариотипа. Среди наиболее часто встречающихся описывают следующие: делеции хромосом 5, 7, 12 пар, трисомии по 8 хромосоме. Изменения, затрагивающие хромосомы 5 или 7 пар (-5/5q-;-7/7q-) встречаются у больных разными вариантами лейкозов. Характерной особенностью данной цитогенетической патологии является то, что она часто выявляется у больных с вторичными лейкозами, индуцированными воздействиями ионизирующей радиации, алкилирующих агентов и других потенциальных мутагенов (Рис.2.5-2). У пациентов с потерей части или целой хромосом 5 или 7 пар отмечены общие клинические особенности, а именно, резистентность или непродолжительный ответ на проводимую химиотерапию, крайне неблагоприятный прогноз. Как правило, больные умирают на ранних стадиях развития заболевания от тяжелых инфекционных или геморрагических осложнений.
В результате молекулярно-генетических исследований обнаружено, что в длинном плече 5 хромосомы локализованы гены интерлейкинов 3, 4, 5, и 6, ген колониестимулирующего фактора для гранулоцитов и макрофагов, ген ростового фактора эпителиальных клеток и ряд других генов. В длинном плече 7 хромосомы находятся гены множественной лекарственной устойчивости 1 и 3 (mdr-1, -3), ген эритропоэтина, МЕТ-онкоген, ген b-цепи Т- клеточного рецептора. Потеря данных генетических последовательностей вследствие делеции 5 или 7 хромосомы или перенос их в другие участки генома в результате транслокации являются, несомненно, важными патогенетическими моментами в развитии заболевания.
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ).
Одним из наиболее частых и хорошо изученных изменений кариотипа у детей с ОЛЛ является гипердиплоидия. Причем, больные с разной степенью гипердиплоидии хромосом в ле