Верификация злокачественных процессов.
Совершенно очевидно, что точно верифицированный диагноз является краеугольным камнем в онкологии вообще и в детской онкологии в частности. Специфическое лечение (химиотерапия, лучевая терапия) может быть начато только после установления диагноза злокачественного процесса. Вид лечения и его интенсивность зависят в первую очередь от биологии злокачественной опухоли. Для выяснения ее природы необходимо достаточное количество биологического материала, получаемого путем пункций и биопсий.(см. главу "Хирургический метод"). И если при лейкемиях основную диагностическую информацию можно получить в течение суток, то при солидных опухолях диагностический процесс требует нескольких дней.
Для верификации диагноза в онкологии используются следующие методы:
1.Светооптическая микроскопия (цитологическое и гистологическое исследования после стандартных окрасок);
2. Электронная микроскопия;
3. Иммунологические исследования (иммунофлуоресценция, иммуноцитохимия и иммуногистохимия);
4. Цитогенетика;
5. Молекулярная биология.
СВЕТООПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ
Значение светооптической микроскопии в детской онкологии имеет большое значение прежде всего в связи с тем, что в результате цитологического или гистологического исследования пунктатов, биопсийного или операционного материала клиницисты получают диагноз, определяющий дальнейшую лечебную тактику. Клеточный или тканевой состав опухоли, степень злокачественности, характер роста, наличие метастазов определяют выбор лечения и прогноз. В свою очередь, для постановки развернутого гистологического диагноза решающее значение имеет качество обработки материала. Кроме того, важно исследовать не только саму опухоль, но и орган, в котором она расположена, для выявления фоновых изменений, что облегчает понимание развития опухолевого процесса. Для приготовления препаратов, пригодных для светооптической микроскопии, биопсийный или операционный материал должен пройти три основных этапа обработки: фиксацию, заливку и окраску.
|
|
Фиксация.
Первым этапом обработки образцов тканей является фиксация. Для качественной фиксации материала необходимо вырезать кусочки исследуемой ткани толщиной 3-5 мм. Наиболее распространенной и универсальной является фиксация в 10% нейтральном формалине в течение 10-24 часов. При изучении трепанобиопсий подвздошной кости с целью состояния костного мозга, материал в течение 1,5-2 часов фиксируется в жидкости Карнуа: спирт абсолютный - 6 частей, хлороформ - 3 части, уксусная кислота (ледяная) - 1 часть.
Заливка.
Фиксированные кусочки исследуемой ткани, после дегидратации, погружаются в очищенный, гомогенизированный парафин. Использование парафина является достаточным для получения срезов толщиной 5 мкм, необходимых для светооптической микроскопии. В последние годы в гистологической практике нашли применение специальные смолы (метакрилаты). При погружении в них практически отсутствует артефакт сморщивания исследуемой ткани. Кроме того, этот метод позволяет получить полутонкие срезы, а также позволяет изготовлять гистологические препараты костной ткани без предварительной декальцинации. При погружении в парафин материала при остеогенных опухолях и трепанобиопсий необходима предварительная декальцинация. Это осуществляется различными методами с использованием органических и неорганических кислот. Одним из оптимальных методов является декальцинация в жидкости де Кастро. Для приготовления 100 мл декальцинирующей жидкости необходимо: хлоралгидрат - 5 г, спирт абсолютный - 30 мл, азотная кислота концентрированная - 8 мл, вода дистиллированная - 57 мл.
|
|
Окрашивание.
Для подавляющего большинства диагностических светооптических исследований используются простые окраски: гематоксилин-эозин, азурII-эозин, Ван Гизон, судан, импрегнация азотнокислым серебром, ПАС-реакция. В тех случаях, когда на основании простых методов окрашивания не удается установить полноценный цитологический или гистологический диагноз, используются методы электронной микроскопии, иммуноцитохимии и иммуногистохимии.
Страница 160 
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
В настоящее время метод электронной микроскопии более эффективно используется в научных исследованиях посвященным патогенетическим и патофизиологическим процессам опухолевого роста, однако в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний у детей этот метод имеет свое применение как дополнительный к световой микроскопии для уточнения некоторых диагнозов. Так например: нейробластома легко диагностируется, когда в опухолевых клетках выявляются плотные стержневидные гранулы; рабдомиосаркому характеризует наличие в клетках миофиламентов; диагноз острого мегакариоцитарного лейкоза подтверждает присутствие специфических тромбоцитарных гранул; Лангерганс-клеточный гистиоцитоз ассоциируется с появлением в клетках гранул Бирбека. При других онкологических заболеваниях также имеются различные ультраструктурные особенности, но они носят неспецифический характер и могут иметь место при различных опухолях. В последнее время рекомендуется проводить электронную микроскопию в сочетании с иммуноцитохимией, но, к сожалению, в России этот метод не имеет широкого применения из-за отсутствия наработанных стандартов и специфичности.
|
|
Этапы обработки и подготовки исследуемого материала для электронной микроскопии аналогичны этапам для светооптической микроскопии, но для проведения ультраструктурного исследования необходимо знать следующее:
1. Размер тканевых кусочков для электронной микроскопии должен быть 1-2 мм3;
2. Тканевых кусочков должно быть несколько и выделять их желательно из различных участков биопсийного материала;
3. Фиксация исследуемого материала осуществляется в 2,5% растворе глютаральдегида на какодилатном буфере и в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере;
4. Время фиксации должно быть не менее 6 часов;
5. Заливка исследуемого материала осуществляется в специальную смесь эпоксидных смол;
6. Окрашивание производиться солями тяжелых металлов - уранилацетат и цитрат свинца;
7. Изготовление ультратонких срезов осуществляется с помощью ультрамикротомов, а срезы монтируются на специальные микросеточки;
8. Окончательное заключение о патологическом процессе не должно основываться только на ультраструктурном исследовании без световой микроскопии.