Иониты представляют собой нерастворимые ВМС, содержащие способные к ионизации функциональные группы и дающие с ионами противоположного заряда нерастворимые соли. Уже давно известны неорганические иониты, для смягчения воды, и только с появлением синтетических органических ионитов процессы ионного обмена стали широко использоваться.
В зависимости от характера ионизирующих групп иониты подразделяют на катиониты и аниониты. Катиониты являются поливалентными нерастворимыми кислотами, образующими нерастворимые соли с катионами или обменивающими один катион на другой. Анионтиты представляют собой органические поливалентные основания, связывающие анионы.
Катионит-SO3H+ + NH4+ - Катионит-SO3NH4++ H+
Катионит-SO3NH4+ + Na+ - Катионит-SO3Na+ + NH4+
Анионит – NH+3 OH - + CH3COO - Анионит – NH+3CH3COO - + OH-
Анионит – NH+3CH3COO - + H+CL - Анионит – NH+3CL - + CH3COO-H+
В качестве ионизирующихся групп катиониты могут иметь ароматические сульфогруппы, фосфатные, карбоксильные группы или ароматический гидроксил. Если в ионите присутствуют ионизирующие группы нескольких типов (полифункциональные), то это не всегда благоприятно сказывается на процессе разделения. Наиболее часто применяются монофункциональные иониты. Способность ионита связывать ионы с противоположным знаком зависит от числа ионизирующихся групп. Емкость ионитов обычно выражают в виде числа миллиэквивалентов на 1гр сухого или на 1гр влажного ионита.
Cтепень сшивания является одной из важных характеристик ионитов. При увеличении степени сшивания ионита ионы в него проникают труднее, равновесие устанавливается медленнее, избирательность повышается, а сопсобность связывать большие ионы уменьшается. Скорость установления равновесия при хроматографии на ионите в значительной мере зависит от размеров частиц. Равновесие устанавливается быстрее в случае относительно небольших частиц, но вместе с тем на них сильнее проявляется нежелательная адсорбция, которая изменяет форму зон разделяемых веществ.
|
|
Степень связывания различных ионов ионитами в водных растворах можно оценить при помощи следующего правила. В случае катионитов сродство возрастает с увеличением валентности иона или при данной валентности с повышением его атомного (молекулярного) веса. В случае анионитов сродство прямо пропорционально силе или основности кислот.
В качестве элюентов используются буферные растворы, а чтобы исключить нежелательные гидрофобные взаимодействия в элюент добавляют метанол или ацетонитрил (не более 5%).
Оптимизация условий разделения.
Изменение рН.
Повышение ионной силы.
Изменение температуры.
Изменение состава буферного раствора.
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
При распределительной хроматографии разделение осуществляется главным образом за счет коэффициентов распределения разделяемых веществ. Согласно закону Нернста, для определенного вещества и определенной системы фаз коэффициент распределения есть величина постоянная, не зависящая от концентрации вещества. Однако, воспроизводимость распределительной хроматографии сильно зависит от концентрации растворенного вещества. При низких концентрациях этим обстоятельством можно пренебречь, но при более высоких концентрациях закон Нернста не соблюдается (см. теория экстракции + Кейл стр.443-452).
|
|
Для получения распределительных систем с полярными твердыми фазами (например, силикагель) рекомендуются тройные смеси растворителей, состоящие из неполярного элюента (например, гептана, дихлорметана), сильнополярного компонента (обычно воды) и низкомолекулярного спирта или другого растворителя, смешивающегося и с водой, и с неполярным компонентом. При подборе системы растворителей жидкую фазу можно удалить промыванием колонки, например, дихлорметаном. После этого колонка пригодна для нанесения новой неподвижной фазы.
Для достижения оптимального разделения необходимо, чтобы разделяемые вещества лучше растворялись в неподвижной фазе. Вещества с коэффициентом распределения, близким к единице, при распределительной вымываются с фронтом подвижной фазы. Гидрофильные вещества лучше разделяются при использовании гидрофильных сорбентов (силикагель, крахмал, целлюлоза), а для разделения гидрофобных веществ можно воспользоваться сорбентами для ОФ хроматографии.
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Макромолекулы БАС отличаются внутри своих индивидуальных групп по физико-химическим свойствам незначительно. Одним из наиболее характерных свойств БАС является способность обратимо связывать другие вещества, называемые в общем случае лигандами или аффинными лигандами (аффинатами). Например, фермент – ингибитор, антиген – антитело. Именно эта способность служит основой для аффинной хроматографии.
Выбор аффинных лигандов осуществляется на основании их биологической природы и биологических свойств разделяемых соединений. Состав элюента подбирается таким образом, чтобы образующийся комплекс, например фермент – ингибитор, на первом этапе элюирования не разрушался, а балластные вещества легко элюировались. Затем, состав элюента меняют таким образом, чтобы разрушить образовавшийся комплекс. Состав элюетна, рН ионная сила также зависят от биологической природы выделяемого соединения.
|
|
Требования к носителям.
Стерическая доступность.
Образование комплекса БАС с лигандом, который ковалентно связан с матрицей требует достаточного пространства. Поэтому одно из выжнейших свойств носителей – высокая пористость. Однако, пористость не играет роли при хроматографии полисом, рибосом, интактных клеток. В этом случае все взаимодействия происходят с поверхностными группами сорбента.
Конформация присоединенного лиганда.
Высокая реакционная способность специфических субстратов обусловлена наиболее благоприятной конфигурацией групп субстрата. Поэтому способы привязки лиганда ограничены, т. к. лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании.
Концентрация БАС, время уравновешивания, скорость потока.
Наносить следует разбавленные растворы БАС, т. к. то связано с диффузией в поры, стерическими затруднениями. Процесс аффинной хроматографии – процесс медленный, т. к. необходимо некоторое время для образования комплекса. Поэтому уменьшение числа теоретических тарелок приводит к увеличению эффективности. Иногда поток элюента останавливают на несколько часов и только потом начинают специфическое элюирование.
Неспецифические влияния.
Неспецифическая сорбция балластных веществ возможна вследствие ионного обмена или гидрофобных взаимодействий.