Занятие 8
Цель:
1. Ознакомиться с основными закономерностями наследственности и изменчивости бактерий и их значением для медицины.
2. Ознакомиться с практическим использованием бактериофагов в медицине и микробиологии.
Знать:
1. Особенности организации генетического материала у бактерий.
2. Изменчивость бактерий: виды, роль в эволюции.
3. Микробиологические основы генной инженерии и биотехнологии.
4. Умеренные и вирулентные бактериофаги, особенности их взаимодействия с клеткой хозяина.
5. Практическое использование бактериофагов в микробиологии и медицине.
Уметь:
1. Выявитьпроявления фенотипической изменчивости (модификации) у бактерий.
Учесть и оценить результаты ПЦР.
2. Установить феномен бактериофагии на плотных и жидких питательных средах, оценить полученные результаты.
Контрольные вопросы:
1. Организация генетического материала у бактерий. Понятие о фенотипе и генотипе.
2. Внехромосомные факторы наследственности (плазмиды, транспозоны, Is-последовательности).
3. F-, Col-, R- плазмиды, плазмиды вирулентности, их фенотипическое проявление, значение.
4. Модификационная изменчивость у бактерий, ее механизмы и формы проявления.
5. Генотипическая изменчивость. Мутации и генетические рекомбинации у бактерий.
6. Механизмы передачи генетической информации у батерий: конъюгация, трансдукция, трансформация.
7. Репарации и их роль в сохранении стабильности генома бактерий.
8. Цели и задачи генной иженерии. Основные этапы генноинженерных манипуляций. Достижения генной инженерии.
9. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.
10. Умеренные и вирулентные бактериофаги, особенности их взаимодействия с клеткой хозяина.
11. Практическое использование бактериофагов в микробиологии и медицине.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Выявить проявления фенотипической изменчивости (модификации):
- культуры Proteus vulgaris, растущей на феноловом агаре; определить ее вид;
- культур S.aureus и Shigella sonnei, растущих на плотной среде;
2. Учесть и оценить результаты ПЦР с целью диагностики герпесной инфекции.
3. Установить наличие дизентерийного бактериофага в испражнениях больных с помощью тест-культуры Shigella sonnei.
4. Провести идентификацию культуры, выделенной из отделяемого длительно незаживающей пупочной ранки новорожденного, с помощью набора видовых бактериофагов.
5. Выявить источник и пути распространения стафилококковой инфекции в родильном доме:
- учесть и оценить результаты фаготипирования культур S.aureus, выделенных от больного ребенка с синдромом ошпаренной кожи, акушерки и смыва с пелинального столика.
6. Ознакомиться и описать в протоколе биопрепараты (диагностические, лечебно-профилактические бактериофаги), указав что они содержат, для чего и как применяются.
7. Контрольная работа “Генетика микроорганизмов. Бактериофагия. Нормальная микрофлора”.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Выявление проявлений фенотипической изменчивости у микроорганизмов.
1.1.Культура Proteus vulgaris, растущая на феноловом и обычном агаре.
Изучите характер роста культуры и ее морфологию в препарате, окрашенном фуксином, при росте культуры на обычном агаре, при ее пересеве на феноловый агар и последующем пересеве с фенолового агара на обычный агар. Установите изменение культуральных и морфологических свойств и определите их тип.
Бактерии рода Proteus – это прямые палочки размером 1-3´0,4-0,8 мкм, подвижные (перитрихи); на твердых средах характерен сплошной рост, а при посеве бляшкой – феномен “роения” (образование концентрически расходящихся зон роста).
1.2.Культуры S.aureus и Shigella sonnei, растущие на плотной среде.
Изучите колонии S.aureus и Shigella sonnei, растущие на плотной среде. Установите изменение культуральных свойств.
Характерным проявлением модификации является разделение однородной популяции на два или несколько типов – диссоциация микрорганизмов. Факторами, вызывающими процессы диссоциации, являются старение культуры, воздействие бактериофага, антибиотиков и др. Проявлениями диссоциации является изменение морфологии колоний: образование из S-форм (англ. “ s mooth ”- гладкий) R-форм (англ. “ r ougl ”- шероховатый) колоний. Такого типа диссоциации характерны для энтеробактерий (E.coli 0 124, S. sonnei). У этих бактерий S-форма является вирулентной, а R-форма – слабо или совсем не вирулентной. Ряд микроорганизмов, наоборот, наиболее вирулентны в R-форме. Это возбудители чумы, сибирской язвы, туберкулеза.
В процессе диссоциации может происходить изменение цвета колоний, что характерно для стафилококков. При этом в процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняется биохимические, антигенные и патогенные свойства микроорганизмов.
2. Учет и оценка результатаов ПЦР с целью диагностики герпесной инфекции.
Учтите и оцените результаты ПЦР с целью диагностики герпесной инфекции.
Выявление нуклеиновой кислоты возбудителей является основой геннодиагностики инфекционных заболеваний. Для этого используют методы гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Наибольшее распростанение получила ПЦР.
ПЦР используется для обнаружения ДНК бактерий, вирусов, грибов с целью диагностики заболеваний и оценки эффективности проводимой терапии. Время проведения ПЦР составляет не более 6-8 ч.
ПЦР основана на использовании процесса амплификации ДНК, позволяющего размножить и выделить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающим исходное количество в 109 и более.
Детекцию ПЦР продукта проводят электрофорезом в агарозном геле с бромистым этидием под УФ-светом с длиной волны 310 нм. Регистрацию результатов можно проводить визуально, с помощью фотографирования или сканирования видеосистемой.
Критерии учета и оценки: наличие определенного размера светящейся полосы желтого цвета на уровне полосы положительного контроля (К+) свидетельствует о положительном результате и наличии ДНК соответствующих микроорганизмов в исследуемом материале.
Критерии достоверности: О достоверности получаемого результата свидетельствуют результаты контролей К- и К+.
В пробе К- полоса ДНК должна отсутствовать. В пробе К+ должна быть видна одна светящаяся полоса ДНК определенного размера.
При этом:
1) Наличие светящейся полосы желтого цвета в отрицательном контрольном образце на уровне положительного контроля следует рассматривать как результат контаминации. В этом случае результаты анализа должны быть обязательно отменены.
2) Наличие светящихся полос желтого цвета выше и ниже полосы положительного контрольного образца могут быть результатом неспецифической амплификации, которые не должны быть приняты во внимание.
3. Определение наличие дизентерийного бактериофага в испражнениях больных с помощью тест-культуры Shigella sonnei.
Учтите и оцените результаты реакции фаголизиса на жидкой среде (МПБ) с испражнениями обследуемых “М” и “Н” и тест-культурой S. sonnei.
Для постановки реакции фаголизиса испражнения обследуемых эмульгируют в физ. растворе, фильтруют через бактериальный фильтр и вносят в МПБ, куда добавляется определенное количество тест-культуры S.sonnei. Одновременно такое же количество тест-культуры S. sonnei добавляют в пробирку с МПБ, не содержащей фильтрата (контроль). После этого пробирки термостатируют при 370С 16-18 часов.
Критерии учета: Реакция фаголизиса на жидкой среде положительная, если в опыте происходит полное просветление; реакция фаголизиса отрицательная, если в опыте среда остается мутной;
Критерии достоверности: отсутствие просветления в контроле.
Критерии оценки: положительная реакция фаголизиса свидетельствует о наличии дизентерийного бактериофага в испражнениях обследуемого и косвенно - о наличии в испражнениях соответствующих бактерий.
Отрицательная реакция фаголизиса свидетельствует о том, что наличие дизентирийного бактериофага не установлено.
4. Фагоидентификация культуры, выделенной из отделяемого длительно незаживающей пупочной ранки новорожденного.
Учтите и оцените результаты реакции фаголизиса с исследуемой культурой и набором видовых бактериофагов (стафилококковый, протейный, синегнойный).
Исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тест-разведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37о С 16-18 часов.
Критерии учета и оценки: Положительный результат реакции фаголизиса – лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличие роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учетом ее фаголизабельности к соответствующему виду.
5. Выявить источник и пути распространения стафилококковой инфекции в родильном доме, для чего учесть и оценить результаты фаготипирования культур S.aureus, выделенных от больного ребенка с синдромом ошпаренной кожи, акушерки и смыва с пелинального столика.
Для определения фаговара стафилококков по методу Креджи-Иенсена чашки с питательным агаром засевают газоном 3-4 часовой бульонной культурой бактерий. Дно засеянной чашки расчерчивают на квадраты по количеству типовых бактериофагов или используют трафарет. В каждый квадрат наносят каплю соответствующего бактериофага в тест-разведении, указанном на ампуле. Для одновременного нанесения бактериофагов используют специальный прибор – апликатор. Чашку помещают в термостат и инкубируют 18-20 часов при 37о С.
Учет и оценка результатов: литическое действие бактериофагов устанавливают по появлению «стерильных» пятен. Стафилококки чаще лизируются не одним, а несколькими бактериофагами. В зависимости от лизирующих культуру бактериофагов стафилококки относят к соответствующим фаговару и фагогруппе.
Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник заражения, а выделение культур разных фаговаров свидетельствует о наличии нескольких источников.
Фаготипирование культур S.aureus имеет эпидемиологическое значение, позволяя выявить источник и пути распространения инфекции. Критерием является идентичность фаговаров штаммов S.aureus, выделенных от больных и потенциальных источников, в частности бактерионосителей. Причем в ЛПУ бактерионосителями S.aureus часто являются медицинские работники.
6. Изучение биопрепаратов.
Ознакомьтесь с диагностическими и лечебно-профилактическими препаратами бактериофагов, занесите результаты в таблицу.
| № пп | Название | Что содержит | Для чего применяется | Как применяется |
7. Подготовка к занятию по теме: «Оценка имунного статуса организма человека»:
7.1. Изучение бактерицидной активности кожи.
Чашку Петри с питательным агаром со стороны дна разделите на две половины; каждую половину разделите на три сектора и обозначьте 1, 2, 3. В секторе 1 проведите посев микрофлоры кожи пальца методом отпечатка; тампоном, смоченным взвесью культуры Sarcina flava, протрите тот же палец и проведите посев методом отпечатка в секторе 2. В секторе 3 посев проведите с того же пальца через 30 минут. Чашку поместите в термостат на 18-24 часа при 37оС.
7.2. Изучение бактерицидной активности слюны.
Посейте взвесь тест-культуры Micrococcus luteus, чувствительной к лизоциму, газоном с помощью тампона. Чашку со стороны дна разделите на 4 сектора и нанесите в каждый сектор по капле слюны обследуемых студентов. Чашку поместите в термостат на 18-24 часа при 37оС.
8. Контрольная работа: «Генетика микроорганизмов. Бактериофагия. Нормальная микрофлора».
Вопросы для самоподготовки:
I. Генетика микроорганизмов.
I.1. Организация генетического материала у бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе.
I.2. Плазмиды бактерий. Строение, особенности репликации; разновидности плазмид, их функции.
I.3. Фенотипическое проявление плазмид. F-, Col-, R-плазмиды и плазмиды патогенности. Их роль в биологии микроорганизмов.
I.4. Подвижные генетические элементы: транспозоны, Is-последовательности. Их строение, функции и роль в эволюции бактерий.
I.5. Виды изменчивости у бактерий. Модификационная изменчивость, ее механизмы и формы проявления.
I.6. Генотипическая изменчивость. Мутации у бактерий, их разновидности. Причины и механизмы возникновения мутаций. Мутагены.
I.7. Репарации и их роль в сохранении стабильности генома бактерий.
I.8. Генетическая рекомбинация у бактерий, ее отличие от генетической рекомбинации у эукариот. Типы генетических рекомбинаций у бактерий (гомологичная, сайт-специфическая, незаконная).
I.9. Механизмы передачи генетической информации у бактерий: коньюгация, трансдукция, трансформация; их использование для получения рекомбинантов с заданными свойствами.
I.10. Цели и задачи генной инженерии. Основные этапы генноинженерных манипуляций. Достижения генной инженерии.
I.11. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний: ПЦР, метод молекулярных зондов.
II. Бактериофагия
2.1. Бактериофаги: строение, химический состав, культивирование
2.2. Умеренные и вирулентные бактериофаги, особенности взаимодействия с клеткой хозяина.
2.3. Лизогения, фаговая конверсия. Практическое применение.
2.4. Практическое использование бактериофагов в медицине и микробиологии.
2.5. Препараты лечебно-профилактических и диагностических бактериофагов. Что содержат, для чего и как используются.
III. Нормальная микрофлора.
3.1.Нормальная микрофлора организма человека: понятие, характеристика (облигатная и факультативная, пристеночная и полостная, условно-патогенная микрофлора).
3.2.Микрофлора различных экотопов: кожи, верхних дыхательных путей, пищеварительной и урогенитальной систем.
3.3.Возрастные особенности формирования нормальной микрофлоры у новорожденных и детей раннего возраста (на примере микробиоценоза кишечника и вагины).
3.4.Влияние метода родоразрешения, условий пребывания в роддоме, характера вскармливания ребенка на формирование нормальной микрофлоры ребенка.
3.5.Функции нормальной микрофлоры человека, влияющие на состояние здоровья.
3.6.Роль нормальной микрофлоры человека в развитии эндогенных инфекций.
3.7.Дисбактериоз: понятие, причины возникновения, меры профилактики, микробиологическая диагностика.
3.8.Особенности состава микрофлоры влагалища в норме и при бактериальном вагинозе (БВ). Причины развития бактериального вагиноза у женщин. Роль БВ в патологии плода ребенка.
3.9.Биопрепараты пробиотиков. Что содержат, для чего и как используются.
Вопросы для самоконтроля:
1. Назовите особенности организации генетического материала у бактерий.
2. В чем состоят различия между плазмидами, транспозонами и Is-последовательностями.
3. Роль R-плазмид в распространении устойчивости к антибиотикам в популяции бактерий.
4. Отличие генетической рекомбинации у прокариотических и эукариотических микроорганизмов.
5. В чем состоят различия между трансдукцией, трансформацией и коньюгацией.
6. Основные принципы генной инженерии.
7. ПЦР: суть, назначение, достоинства в диагностике инфекционных заболеваний.
8. Чем определяется специфичность бактериофагов?
9. Назовите особенности взаимодействия умеренных и вирулентных бактериофагов с клеткой хозяина.
10. Фаговая конверсия и ее роль в биологии микроорганизмов.
11. Обосновать преимущество бактериофагов в лечении и профилактике инфекционных заболеваний.
12. Обосновать возможность применения бактериофагов для выявления источников и путей распространения инфекций.
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С.84-90, 92-120.
2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С.39-65.
3. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология / Под ред. Л. Б. Борисова, А. М. Смирновой. - М.: Медицина, 1994. – С.75-105.
4. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С.80-88, 107-111, 268-271.
5. Тимаков В. Д., Левашев В. С., Борисов Л. Б. Микробиология. - М.: Медицина, 1983. – С.87-124.
Практикумы:
1. Борисов Л. Б., Козьмин-Соколов Б. Н., Фрейдлин И. С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: Медицина, 1993. – С.44-47, 54-59.
2. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней / Под ред. Ю. С. Кривошеина. - Киев, 1986. – С.31-32.
Лекции по микробиологии.
Тесты.