Методы культивирования анаэробных бактерий
Культивирование анаэробных бактерий как спорообразующих (клостридии). так и неспорообразующих (вейлонеллы, бактероиды и др.) производят в анаэробных условиях.
Анаэробные условия можно создать при культивировании в анаэростате. эксикаторе (на дно которого устанавливается зажженная свеча, либо наливается щелочной раствор пирагалола. поглощающий кислород) и биологическим методом по Фортнеру. Малкиной и т.д.
При посеве методом Фортнера чашку Петри с толстым слоем питательного агара делят пополам, вырезанной полоской. На одну половину агара сеют культуру аэроба, на другую - анаэроба. Чашку заливают парафином и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробных бактерий. Когда же они исчерпают из чашки весь кислород, начинается рост анаэробов.
При посеве по методу Малкиной используют две пробирки со скошенным МПА, соединенных трубкой. В одну пробирку сеют культуру аэроба, в другую - анаэроба. Когда исчерпается кислород при росте аэробных бактерий, начинается рост анаэробных.
Посевы анаэробов производят на среде Китта-Тароцци. состоящей из МПБ. 0.5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша. Перед посевом среду прогревают в водяной бане в течение 10-15 мин для удаления воздуха и остужают. После посева среду заливают слоем вазелинового масла или парафином с целью изоляции от атмосферного воздуха.
Выделение чистых культур анаэробных бактерий
В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур анаэробов используются методы Цейсслера или Вейнберга. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.
Метод Цейсслера
|
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы микробов исследуемый материал засевают на среду Китта-Тароцци. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% раствором ЫаС1. Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, подписывают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.
Второй этап. На следующий день посевы просматривают и описывают характер роста. Приготавливают мазки, окрашивают по Граму. микроскопируют, описывая морфологические и тинкториальные свойства бактеркй. Затем производят пересев в чашки Петри на сахарно-кровяной агар, для получения изолированных колоний. Чашки помещают в анаэростат и термостатируют при температуре 37 "С 18-24 ч.
Третий этап. Просматривают посевы, изучают изолированные колонии и описывают характер роста. Морфологию бактерий исследуют приготовлением мазка из колонии, окрашенного по методу Грама. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев подозрительной колонии в пробирку со средой Китта-Тароцци. Пробирки термостатируют 18-24 часа при температуре 37 "С.
Четвертый этап. Отмечают визуальный характер роста чистой культуры. Проводят проверку чистоты выделенной культуры, для чего ее микроскопируют (чистая культура морфологически и тинкториально однородна).
Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических. протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий имеют важное таксономическое значение, широко применяясь для ах систематики и идентификации. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.
|
Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий - эндоферменты, другие - экзоферменты, выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений.
Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название - мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране).
У бактерий различают три основные группы ферментов:
1. Конститутивные - постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.
2. Индуцибелъные - синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.
3. Репрессибельные - синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.
Для идентификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические, протеолитические свойства бактерий, пигменто- и токсинообразование.
|
Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов.
Определение сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса. состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NаОН). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет Результаты посевов учитываются через 24-48 часов. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды (она приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.
Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, катализирующие расщепление белка
Для определения протеолитических ферментов - коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ.
На практике о протеолитической активности бактерий чаще судят по способности расщеплять белок до продуктов глубокого распада: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуры засевают на МПБ. между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород - индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н:8 - она чернеет), а на индол - индикаторная бумага пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола - она краснеет).
В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) или мультимикротссты (ММТ).’
СИБ - набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. ММТ - представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета индикаторных дисков (при использовании СИБ) или содержимого лунок (при использовании ММТ) судят о биохимических свойствах культуры.
Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и его цвет используется для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый, золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки; желтый, кремовый - микобактерии туберкулеза; рубиново-красный – серрации; сине- зеленый - синегнойная палочка.
Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации.
Характеристика бактериальных токсинов
Токсические вещества, синтезируемые бактериями, по своей химической природе относятся к белкам и липополисахаридам (ЛПС). Первые, как правило, секретируются живой бактериальной клеткой и поэтому получили название - экзотоксины. Вторые освобождаются после гибели клетки - эндотоксины.
Эндотоксины - ЛПС. Содержащиеся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий. Токсические свойства эндотоксина определяются всей молекулой ЛПС. Эндотоксины в отличие от экзотоксинов более устойчивы к повышенной температуре, менее ядовиты, малоспецифичны, слабо иммуногенны.
Эндотоксины различных грамотрицательных микробов при введении в организм подопытных животных вызывают однотипную реакцию. При введении больших доз токсина у животных наблюдаются угнетение фагоцитоза и явления выраженного токсикоза (слабость, одышка, диарея, падение сердечной деятельности, понижение температуры тела). При введении небольших доз отмечается обратный эффект: стимуляция фагоцитоза, менее выраженный токсикоз, повышение температуры тела.
У людей поступление большого количества эндотоксина в кровяное русло приводит к токсико-септическому шоку. В результате чего наблюдается снижение артериального давления, как результат поступления повышенного количества серотонина и кининов в кровь, а также нарушение кровоснабжения органов и ацидоз. Действие эндотоксинов на клетки крови (гранулоциты, моноциты) приводит к лихорадке, так как из них выделяются эндогенные пирогены. Начало лихорадки совпадает с ранней лейкопенией, которая сменяется вторичным лейкоцитозом.
Некоторые бактерии способны одновременно синтезировать как эндотоксины, так и белковые токсины, например возбудитель холеры, чумы сальмонеллеза и др.
Белковые токсины - экзотоксины - в зависимости от связи со стромой бактериальной клетки, подразделяются на секретируемые, частично секретируемые и несекретируемые. Описано свыше 80 различных экзотоксинов, отличающихся друг от друга по молекулярной массе, химической структуре, «клеткам-мишеням» макроорганизма и биологической активности. Возможно, белковые токсины предназначены не только для поражения клеток, тканей и органов человека но и для участия в метаболических реакциях самих бактерий, их продуцентов.
По отношению к температуре различают: термолабильные и термостабильные белковые токсины. Так, например, термолабильный дифтерийный токсин разрушается при температуре 60 0С в течение 1 часа, а столбнячный - в течение 20 мин. Термостабильные токсины клостридий ботулизма, кишечной палочки, стафилококков могут переносить кратковременное кипячение.
Все экзотоксины состоят из двух составных частей. Одна - является рецептором и служит для фиксации молекулы токсина на соответствующей «клетке-мишени», вторая - собственно токсический фрагмент - проникает внутрь клетки, блокируя жизненно важные метаболические реакции.
Высокая токсичность белковых токсинов объясняется особенностью строения токсического фрагмента, имитирующего структуру гормонов, ферментов и нейромедиаторов макроорганизма. Это делает их антиметаболитами вышеупомянутых жизненно важных соединений, блокирующих функциональную активность последних.
Специфичность токсического действия экзотоксинов определяется избирательной фиксацией токсина на рецепторах «клеток-мишеней» определенных тканей (эпителиальной, нервной и др.) организма человека и животных. Различия в механизме действия данных токсинов позволили классифицировать среди них четыре группы, каждая из которых состоит из нескольких подгрупп (табл. 1).
Цитотоксины - блокируют синтез белка на субклеточном уровне. Например, антиэлонгаторы (дифтерийный гистотоксин, токсин синегнойной палочки и др.). выводят из строя фермент трансферазу II. ответственную за элонгацию (наращивание) полипептидной цепи на рибосомах.
К данной группе также относятся дермонекротоксины. поражающие клетки кожи и энтеротоксины. поражающие клетки слизистой кишечника.
Классификация основных групп белковых токсинов
Тип | Группа, подфуппа | Возбудитель - продуцент |
Цитотоксины | Антиэлонгаторы Энтеротоксины Дсрмонекротоксины | |
Мембранотоксины | Лейкоцидины Гемоличины с фосфатида зной активностью О-стрептолизин. Пневмоличин А-токсин Тетанолизин | |
Функциональные блокаторы | Термостабильныс Энтеротоксины. Термолабильные энтеротоксины. Холероген Токсиблакаторы «мышиные» токсины Коклюшный стимулирующий фактор Нуйротоксины | |
Эксфолиатины, эритрогенины | Эксфолиатины Эритрогенины |
Вторая группа - «мембранотоксины» - повышают проницаемость мембраны эритроцитов (гемолизины) и лейкоцитов (лейкоцидины), вызывая их гибель.
Третья группа - «функциональные блокаторы» - включает термолабильные и термостабильные энтеротоксины. активизирующие клеточную аденилатциклазу, приводя к повышению проницаемости стенки тонкой кишки и увеличению выхода жидкости в ее просвет - диарее. Эта группа включает, например, холероген, продуцируемый холерным вибрионом, термолабильные энтеротоксины кишечной палочки и других энтеробактерий.
Токсикоблокаторы. «мышиные» токсины, вырабатываемые сибиреязвенной и чумной палочками, в отличие от энтеротоксинов инактивируют аденилатциклазу, являясь антагонистами данного фермента.
Нейротоксины (тетаноспазмин, ботулинический токсин) блокируют передачу нервных импульсов в клетках спинного и головного мозга.
Четвертая группа - эксфолиатины (продуцируемые золотистым стафилококком) и эритрогенины (образуемые скарлатинозным стрептококком), влияют на процессы межклеточного взаимодействия.
Экзотоксины обладают высокой иммуногенностью, что проявляется в способности вызывать иммунный ответ со стороны макроорганизма, в частности индуцировать синтез специфических антител - антитоксинов, нейтрализующих гомологичный токсин.
Ряд белковых токсинов, например столбнячный, дифтерийный, ботулинистический, гангренозный и др., под действием формалина утрачивают свою ядовитость, сохраняя при этом иммуногенные свойства. Такие токсины получили название - анатоксинов. Они применяются в качестве вакцин для профилактики одноименных заболеваний. Например, вакцина АКДС, содержащая столбнячный и дифтерийный анатоксины.
Многие бактерии (стафилококки, стрептококки и др.) образуют не один, а несколько белковых токсинов, обладающих разным действием.
Токсигенность бактерий изучают в опытах на чувствительных лабораторных животных
Практическая часть занятия
Цель занятия:
· изучить методы культивирования и выделения чистых ку льту р анаэробных бактерий;
· изучить биохимические свойства бактерий и методами их определения.
Мотивационная характеристика темы:
Изучение биохимических свойств бактерий наряду с определением морфологических, тинкториальных и культуральных свойств позволяет идентифицировать микроб и установить его роль в качестве возбудителя инфекционного заболевания.
Студент должен знать:
· классификацию микроорганизмов по способу дыхания
· методы культивирования анаэробов
· основные методы выделения чистых культур анаэробов
· основные тесты, характеризующие биохимические свойства микробов
Студент должен уметь:
· выделять чистую культуру бактерий;
· должен уметь идентифицировать выделенную культуру по морфологическим, тинкториальным, культурным и биохимическим свойствам.
Студент должен иметь навыки:
· соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологических лабораториях:
· обеззараживания инфицированного материала, антисептической обработки рук, контаминнрованных исследуемым материалом:
· стерилизации бактериальных петель прокаливанием;
· посева и пересева исследуемого материала на питательные среды;
· идентификации изучаемой культуры по биохимическим тестам.
Оснащение занятия:
На группу:
1. Таблицы: «Выделение чистой культуры анаэробов», «Методы культивирования анаэробов».
2. Таблицы: «Биохимические свойства бактерий», «Ферментативная активность бактерий кишечно-тифозной группы», «Токсины бактерий».
3. Анаэростат, эксикатор.
4. Демонстрация роста анаэробов на среде Китта-Тароцци
5. Демонстрация сахаролитических и протеолитических свойств кишечной палочки на средах Гисса.
На рабочее место:
1. Микроскоп.
2. Посевы исследуемого материала (прошлого практического занятия) на чашках Петри с МПА.
3. Пробирка со скошенным агаром.
4. Чистая культура грамотрицательной палочки на скошенном агаре.
5. Пробирки со средами Гисса: глюкозой, лактозой, сахарозой.
6. Пробирка с МПБ.
7. Индикаторные бумажки на индол и сероводород.
8. Пинцет, бактериологическая петля.
9. Спички, карандаш по стеклу.
10. Спиртовка.
11. Набор для окраски по методу Г рама.
12. Пробирка с физраствором.
13. Предметные стекла.
14. Пробирка с исследуемым материалом на обнаружение анаэробов.
15. Пробирка со средой Китта-Тароцци.
16. Банка с дезраствором.
Учебная карта занятия:
1. Продолжить протокол №1 по выделению чистой культуры аэробных бактерий:
а) изучить посевы на чашке с МПА;
б) отобрать подозрительную колонию и описать ее;
в) приготовить из колонии мазок, окрасить по Граму и промикроскопировать.
г) отсеять подозрительную колонию на скошенный агар.
д) результаты внести в протокол.
2. Изучить биохимические свойствами микроорганизмов по таблицам и демонстрационным материалам.
3. С целью идентификации чистой культуры грамотрицательной палочки определить:
а) сахаролитические свойства, сделав посев на среды Гисса (с глюкозой, лактозой, сахарозой);
б) протеолитические свойства, сделать посев на МПБ и внети в пробирку индикаторные бумажки на сероводород и индол;
в) ход исследования оформить в виде протокола №2.
4. Ознакомиться с методами культивирования анаэробных бактерий по таблицам и демонстрационным материалам.
5. Провести посев исследуемого материала на среду Китта-Тароцци для выделения анаэробных бактерий. Ход исследования оформить в виде протокола №3.
Протокол №1