Тема: Изучение и описание кариотипа

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1-2

Цель работы: ознакомиться с основными методами определения кариотипа, структурными изменениями генома и хромосом, а также правилами записи кариотипа организмов.

Кариотип – полный набор числа хромосом соматической клетки, обладающих определенной формой и размерами, характерными для данного организма. Термин «кариотип» был введён в 1924 году советским цитологом Г.А. Левитским.

Важная особенность хромосом заключается в том, что хромосомы как индивидуаль­ные структуры становятся доступными для исследова­ния после значительного уко­рочения и утолщения, кото­рые они испытывают в период подготовки клетки к деле­нию. Для соматических клеток таким делением является метафазная пластинка митоза, для генеративных — метафазная пластинка сначала митоза, а затем мейоза.

Кроме того, исследуются только те метафазные хромосомы, хроматиды которых отделились друг от друга в области плечей, а в центромерной части еще соединены. Совокупность всех метафазных хромосом, расположенных относительно произвольно в экваториальной плоскости клетки, именуется метафазной пластинкой или просто хромосомным набором.

В 1960 – Мурхед и сотр. (США) разработали метод приготовления препаратов хромосом из кратковременной культуры лимфоцитов; в 1968-70 гг. разработаны методы дифференциального окрашивания хромосом, что позволило однозначно идентифицировать все хромосомы человека (рис. 1, рис. 2).

Рис. 1. Нормальный хромосомный набор женщины (в правом нижнем углу две X-хромосомы).

Рис. 2. Нормальный хромосомный набор мужчины (в правом нижнем углу - Х- и Y-хромосомы).

После приготовления препаратов хромосом, которые можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки, хромосомы окрашиваются. После окрашивания их можно различить в световой микроскоп, получить микрофотографию, идентифицировать и, расположив их в определенном порядке, составить кариограмму, т.е. получить целостное представление о кариотипе конкретного человека.

Кариограмма - это те же хромосомы метафазной пластинки, но расположенные упорядоченно. Принцип упорядоченности общий для всего вида и определяется идиограммой.

Идиограмма - это графическое изображение гаплоидного набора хромосом (можно и диплоидного) и расположение их по группам в зависимости от формы и величины.

Группы располагаются в порядке уменьшения величины входящих в них хромосом. В современных цитогенетических лабораториях процесс составления кариограммы компьютеризирован.

Для кариотипа используется запись в системе Международной цитогенетической номенклатуры (International System for Cytogenetic Nomenclature) ISCN 1995, имеющая следующий формат:

1.количество хромосом

2.половые хромосомы

3. особенности.

Для обозначения половых хромосом у различных видов используются различные символы (буквы), зависящие от специфики определения пола таксона (различные системы половых хромосом). Так, у большинства млекопитающих женский кариотип гомогаметен, а мужской гетерогаметен, соответственно, запись половых хромосом самки XX, самца — XY. У птиц же самки гетерогаметны, а самцы гомогаметны, то есть запись половых хромосом самки ZW, самца — ZZ. Например, нормальный кариотип женщины: 46, XX; нормальный кариотип мужчины 46, XY. Длинное плечо хромосомы обозначают буквой q, короткое — буквой p.

Кроме диплоидного числа хромосом в кариотипе часто обозначают число двуплечих хромосом (мета- и субметацентрических); иногда при определении Ч.х.п. двуплечими считают и телоцентрические хромосомы. Для этого показателя применяют обозначение NF - число хромосомных плеч. Также для идентификации хромосом проводят морфометрический анализ длины хромосомы и соотношение их плеч (центромерный индекс).

С самого начала, при стандартном равномерном окрашивании хромосом была заметна некоторая неоднородность в плот­ности окрашивания по длине хромосом, однако это явление не имело объяснений. В конце 60-х годов XX века был осуществлен важный прорыв в исследовании хромосом, когда для их окрашивания начали использовать специальное контрастное вещество — акрихин-иприто. Такая окраска позволила выявить внутри хромосом большое число разных субструктур, которые не обнаруживались под микроскопом без окрашивания. После окрашивания хромосом красителем Гимза-Романовского они выглядят как зебры: вдоль всей длины видны поперечные светлые и темные полосы, имеющие окраску разной интенсивности.

Эти полосы получили название хромосомных G-сегментов или полос (рис. 3).

Рис. 3. Специфические хромосомные G-сегменты, выявляемые при окраске хромосом человека, и система их обозначения согласно решению международной конференции в Париже в 1971 году. Цифрами под хромосомами указаны их номера. X и Y — половые хромосомы, p — короткое плечо, q — длинное плечо хромосом

На Парижской конференции по стандартизации и номенклатуре хромосом человека (1971) все полученные к тому времени данные по дифференциальному окрашиванию хромосом были сопоставлены и оказалось, что все методы в принципе выявляют одни и те же структуры, но каждый специфичен в отношении определенных сегментов. И обозначать различные типы сегментов решили по методам, с помощью которых они выявляются.

Q-окрашивание — окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаизма с участием Y-хромосом)

G-окрашивание — модифицированное окрашивание по Романовскому-Гимзе. Чувствительность выше, чем у Q-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы)

R-окрашивание — используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

C-окрашивание — применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин и вариабельной дистальной части Y-хромосомы.

T-окрашивание — применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Картина сегментации сильно отличается у разных хромосом, но расположение хромосомных сегментов постоянно у каждой из хромосом во всех типах клеток человека. Природа полос, выявляемых при окраске, до конца еще не ясна. Сейчас установлено только, что участки хромосом, соответствующие темным полосам (названные R-полосами), реплицируются раньше, чем светлые участки (названные G-полосами). Хотя детальные процессы, происходящие при окрашивании, еще не до конца ясны, очевидно, что картина окраски зависит от такого параметра, как увеличенное или уменьшенное содержание в отдельных полосах хромосом АТ или ГЦ-пар.

Совершенствование методов окрашивания хромосом позволило выявить до 1000 полос на всех 23-х хромосомах человека, характерных для гаплоидного набора. В среднем на хромосому при этом приходится 50 полос, хотя на некоторых хромосомах их можно обнаружить в несколько раз больше, чем на других.

При описании кариотипа используются следующие обозначения:

Латинскими буквами р и q обозначаются соответственно короткое и длинное плечо, в каждом плече выделяются районы, обозначенные арабскими цифрами, районы нумеруются от центромеры к теломерным участкам хромосомы. А уже внутри района выделяются сегменты (англ. bands), обозначенные арабскими цифрами по такому же принципу, т.е. сегмент имеет свой символ, например, 1 q 32 - второй сегмент третьего района в длинном плече 1 -ой хромосомы (при чтении справа налево). Запись 5p15.2. означает: 2-я полоса 15-го участка короткого плеча 5-й хромосомы.

Сравнение комплексов поперечных меток хромосом помогает идентифицировать как гомологичные хромосомы, так и отдельные их участки, что позволяет детально определять хромосомные аберации — внутри- и межхромосомные перестройки, сопровождающиеся нарушением порядка фрагментов хромосом.

Различают следующие типы структурных изменений хромосом: транслокация - обмен участками в пределах одной хромосомы или между разными хромосомами; инверсия - перевертывание участков хромосом на 180°; дупликация - удвоение участков хромосом, инсерция - вставка в каком-либо участке нуклеотидной последовательности и делеция - потеря отдельных участков. В некоторых случаях хромосомные перестройки могут приводить к изменению числа хромосом или хромосомных плеч. Такие типы перестроек хромосом, центрические слияния и разделения, названы по имени цитогенетика К. Робертсона (Великобритания), который в 1916 году впервые их описал. Их называют робертсоновскими транслокациями. Хромосомные аберрации обозначаются дополнительными символами: делеция обозначается del, инверсия - inv, дупликация - dup, транслокация - t, инсерция – ins, кольцевая хромосома - r, iso - изохромосома по плечу, указанному в круглых скобках.

При описании структурных аномалий кариотипа вначале, указывается общее количество хромосом, затем - набор половых хромосом, определяющих пол обследованного, после чего ставится запятая и приводится описание характера структурной перестройки: делеция, инверсия, дупликация, транслокация, инсерция. После этого, в скобках, указывается номер хромосомы, например: 46,XY, del(2) означает потерю участка на второй хромосоме у мужчины. Запись 46,XY,del (2)(2q 14.1) более детальная и означает, что произошел разрыв в первой субъединице четвертого сегмента первой полосы длинного плеча второй хромосомы.

При межхромосомных обменах после запятой указывают номера хромосом, вовлеченных в перестройку. Если в перестройку были вовлечены две хромосомы (и более), то для отделения их друг от друга ставится точка с запятой и первой записывается хромосома, имеющая меньший номер. В том случае, если удается идентифицировать сегменты, подсегменты и полосы хромосом, в которых произошли разрывы, то они указываются в следующих скобках. Например, кариотип мужчины с транслокацией 21-х участков короткого (p) и длинного плеч (q) 1-й и 3-й хромосом и делецией 22-го участка длинного плеча (q) 9-й хромосомы (приведён на рис. 4): 46, XY, t(1;3)(p21;q21), del(9)(q22)

Рисунок 4.

Кроме структурных изменений самих хромосом может меняться и количество хромосом. Клетки разных тканей даже одного организма в зависимо­сти от выполняемой функции могут содержать разное число хромосом. Так, например, в клетках печени животных бывает большее, чем два, число наборов хромосом (т. е. 4n, 8n). Некоторые виды растений могут быть представлены формами, отличающимися числом хромосом, кратным гаплоидному. Так, рожь (Secale cereale) может иметь 2 n (14 хромосом) или 4n (28 хромосом). При этом все видовые признаки у обеих форм ржи сохраняются.

Такое явление - увеличение числа хромосом в организмах одного биологического вида сверх диплоидного числа (2n), кратно гаплоидному числу хромосом: 3n, 4n и т. д. называется полиплоидией. Полиплоидия была открыта Э. Страстбургером (Германия) в 1910 году. Полиплоидия регулярно встречается у растений и редко у животных (только у холоднокровных). Различают автополиплоидию (удвоение собственного набора хромосом) и аллополиплоидию — соединение в одном биологическом виде диплоидных хромосомных наборов двух видов-предшественников. Существует также анеуплоидия — некратное изменение числа хромосом: потеря или добавление в хромосомном наборе отдельных хромосом. Все типы изменения числа хромосом объединяются понятием геномные перестройки.

В случае численных аномалий хромосом (полиплоидии) первым приводится общее количество хромосом, кратное гаплоидному. Например:

- триплоидный кариотип человека записывается так: 69,ХХУ или 69,ХХХ;

- кариотип лошади с «лишней» X-хромосомой (трисомия по X-хромосоме): 65, XXX;

При наличии анеуплоидий по аутосомам после указания общего количества хромосом и пола человека ставится знак «+» при увеличении количества хромосом в одной паре или знак «—» при уменьшении. Например, трисомия по 18 хромосоме у мужчины записывается как: 47,XY,+18, а моносомия по 13 хромосоме в женском кариотипе записывается как 45,ХХ,-13. Напомним, что полная моносомия по любой аутосоме летальна и может определяться только у абортусов и мертворожденных.

Несколько по-иному записываются количественные перестройки, затрагивающие половые хромосомы. Если произошло увеличение или уменьшение числа половых хромосом, то знак «+» или «-» не ставится, а просто записываются их символы в необходимом количестве.

Хромосомные перестройки могут обнаруживаться во всех клетках организма (полная форма хромосомного синдрома) или в определенном клоне клеток (мозаичная форма).

Полные формы хромосомных аномалий могут быть унаследованы от родителей, при наличии носительства ими хромосомной перестройки или возникать de novo в одной единственной гамете, давшей начало новому организму.

Появление мозаицизма обусловлено возникновением мутаций в зиготе, сформированной нормальными гаметами в процессе клеточного деления во внутриутробном периоде. При обнаружении мозаицизма обозначение кариотипов различных клеточных клонов разделяются косой чертой (/). Например, запись кариотипа 45,Х/47,ХХХ (50%/50%) означает, что при цитогенетическом исследовании препарата обнаружены два клона клеток — один с моносомией по Х-хромосоме, а другой с трисомией по Х-хромосоме, в соотношении 1:1. Согласно требованиям современной номенклатуры в конце записи в квадратных скобках должны быть указаны абсолютные количества клеток в клоне каждого типа, обнаруженные при цитогенетическом исследовании.

Некоторые болезни, вызванные аномалиями кариотипов человека:

Синдром Клайнфельтера (полисомия по X-хромосоме у мужчин): 47,XXY; 48,XXXY;

Синдром Шерешевского — Тёрнера (моносомия по X хромосоме, в том числе и мозаицизм):

45X0; 45X0/46XX; 45,X/46,XY; 46,X iso (Xq)

Полисомии по X хромосоме (наиболее часто — трисомия): 47,ХХX; 48,ХХХХ; 49,ХХХХХ X;

Синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме): 47,ХХ, 21+; 47,ХY, 21+;

Возможен также вариант синдрома Дауна, в основе которого лежит транслокационная форма трисомии по типу робертсоновской перестройки, в которую вовлекаются акроцентрические хромосомы. Кариотип такого больного включает пару нормальных хромосом 21 и третью 21-ю хромосому (либо ее фрагмент), которая является частью структуры хромосомы из другой пары, например хромосомы 15;

Синдром Эдвардса (трисомия по 18-й хромосоме): 47,ХХ, 18+; 47,ХY, 18+;

Синдром Патау (трисомия по 13-й хромосоме): 47,ХХ, 13+; 47,ХY, 13+;

Синдром кошачьего крика (делеция короткого плеча 5-й хромосомы): 46,XX, 5р-;

Синдром Прадера-Вилли (аномалия 15 хромосомы): 46 XX или ХУ, 15р-.

Синдром де Груши (18p-) описан в 1964 г. Характеризуется микроцефалией, нарушениями лицевого скелета, умственной отсталостью, аномалиями половых органов.

Синдром Фурлин (11q-), описанный в 1975 г., проявляется в задержке роста и психомоторного развития, тригоноцефалии, аплазии дистальных фаланг пальцев рук.

При появлении кольцевой хромосомы 9 (r9) наблюдаются микроцефалия, косой разрез глаз, эпикантус, небольшой экзофтальм, дугообразные брови, короткая шея, умственная отсталость.

Выполните задания:

1. При изучении фотокопии хромосомного комплекса человека были проведены измерения и определены следующие относительные размеры короткого (р) и длинного (q) плеча отдельных хромосом (p/q):

1) 3,1/4,9; 2) 1,7/4,3; 3) 1,7/3,3; 4) 0,6/3,0; 5) 1,2/2,1; 6) 0,6/1,4.

1. Рассчитайте центромерный индекс (в %) для каждой из указанных выше хромосом исследуемого кариотипа по формуле: р/(р + q).

2. В нормальном кариотипе человека присутствуют 44 аутосомы и 2 половые хромосомы (XX или XY). В случае одной из форм истинного гермафродитизма (наличие у индивидуума одновременно мужских и женских половых желез) в организме обнаруживают мозаицизм, т.е. два клона клеток, отличающихся по составу половых хромосом (XX/XY ). Сделайте символическую запись нормального кариотипа женщины и мужчины. Сделайте запись кариотипа человека с истинным гермафродитизмом.

3. Укажите знаками (+) либо (-) против каждого из наборов хромосом соответствующие им характеристики, заполнив табл. 1. Схематическая запись различных наборов хромосом

4. Расшифруйте следующие условные обозначения: 1) 3р 13; 2) 3q29; 3) 3p26; 4) 4p14; 5) 4q26; 6) 4q13. Отметьте стрелками соответствующие сегменты на схеме этих хромосом (рис. 5,а).

Рисунок 5, а. Рисунок 5, б.

5. На рис. 5, б приведена схема 11-й хромосомы человека, на которой картирован ген инсулина, локус гена имеет координаты 11p5. Найдите место этого гена на хромосоме.

6. Используя информацию табл. 2, определите, с каким видом нарушений связаны перечисленные кариотипы человека и укажите свой ответ знаками (+) либо (-) в соответствующей графе.