Тема занятия: «КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ»
Цель: изучить влияние на активность фермента активаторов и ингибиторов, концентрации фермента и субстрата, регуляцию ферментативной активности, применение ферментов в медицине.
Внеаудиторная работа
Вопросы для самоподготовки:
1. Понятие о кинетике ферментативных реакций.
2. Влияние на скорость ферментативной реакции: рH среды, температуры, концентрации субстрата и фермента. Константа Михаэлиса.
3. Виды активации ферментов: ковалентная модификация (ограниченный протеолиз, присоединение различных групп), нековалентное активирование (аллостерическое), активация ионами.
4. Ингибирование ферментов: специфическое и неспецифическое, обратимое и необратимое, конкурентное и неконкурентное, аллостерическое.
5. Методы определения активности ферментов. Принцип количественного определения ферментов. Единицы активности.
6. Регуляция активности ферментов.
7. Применение ферментов и ингибиторов ферментов в медицине.
Аудиторная работа
Пользуясь учебником, конспектом лекций, выполните следующие задания по теме:
1. Почему скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента и субстрата.
2. Представьте в виде схемы аллостерическую активацию и ингибирование фермента.
3. Объясните процесс торможения холинэстеразы прозерином.
4. В каких единицах измеряется активность энзимов? Какова активность амилазы слюны?
5. Назовите принципы, лежащие в основе классификации ферментов.
6. Перечислите основные классы ферментов.
7. Объясните, что такое шифр фермента на примере: а) алкогольдегидрогеназы - К.Ф. 1.1.1.1; б) лактатдегидрогеназы - К.Ф. 1.1.1.27.
8. Объясните клиническое значение определения активности амилазы мочи и крови.
9. Амилаза – фермент поджелудочной железы, участвующий в процессе пищеварения. Какую реакцию катализирует амилаза? Какова ее активность в сыворотке крови и моче здорового человека? Как можно подтвердить диагноз острого панкреатита?
10. За 5 минут 1 мг фермента сукцинатдегидрогеназы катализирует окисление янтарной кислоты с образованием 10 мкмолей фумаровой кислоты при 370С и рН 7,0. Рассчитайте удельную активность фермента в оптимальных условиях и объясните, как и почему изменится активность фермента, если:
а) рН инкубационной смеси 4,0;
б) к среде добавить малоновую кислоту;
в) в присутствии малоновой кислоты увеличить концентрацию янтарной кислоты.
11. Холинэстераза при оптимальных условиях (рН 8,4 и t =370C) в течение 15 минут катализирует гидролиз ацетилхолина с образованием 100 мкмолей холина и уксусной кислоты. Рассчитайте активность фермента. Объясните, как и почему изменяется активность фермента, если:
а) температуру инкубационной смеси изменить от 5 до 400С;
б) в инкубационную среду добавить прозерин;
в) в присутствии прозерина повысить концентрацию ацетилхолина.
Лабораторные работы
Работа № 1. Влияние прозерина на активность холинэстеразы
Принцип метода: холинэстераза расщепляет ацетилхолин - медиатор нервного возбуждения - на холин и уксусную кислоту. В процессе ферментативной реакции происходит закисление среды за счет накопления уксусной кислоты, что можно обнаружить с помощью индикатора. Добавление прозерина - структурного аналога ацетилхолина – ингибирует реакцию по принципу конкурентного торможения. Берут две пробирки, в них вносят следующие компоненты:
| Компонент | 1-я пробирка | 2-я пробирка |
| Экстракт мозговой ткани | 2,5 мл | 2,5 мл |
| 0,2% раствор бромтимолсинего | 8-10 капель | 8-10 капель |
| Прозерин | 2 капли | --- |
| 0,5% раствор ацетилхолина | 8-10 капель | 8-10 капель |
После добавления перечисленных компонентов содержимое пробирок перемешивают и отмечают исходную окраску. Инкубируют 30 мин. Следует обратить внимание на изменение окраски во второй пробирке и сделать вывод.
Работа № 2. Влияние активатора и ингибитора на активность амилазы слюны.
Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не принимают участия в реакции. Ингибиторы это вещества, вызывающие частичное или полное торможение ферментативной активности.
Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл слюны, разведенной в 50 раз. В 1-ю пробирку добавляют 2 капли воды, во 2-ю – 2 капли 1% раствора NaCl, в 3-ю – 2 капли 1% раствора CuSO4. После этого в каждую пробирку добавляют по 5 капель 1% раствора крахмала. Все три пробирки оставляют при комнатной температуре на 2 минуты, затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают, наблюдают окраску и определяют, в какой пробирке действует активатор или ингибитор.