Введение
Разнообразие клеточных функций регулируется fluc-tuations от цитозольной концентрации Са2+, Внутриклеточные Са2+ Концентрация [Са2+]я Главная полученных экспериментальных на очень низком уровне (порядка 10-7 М) по сравнению с таковым в внеклеточной среде (около 10-3М). Такой низкий показатель 10-7 М относится только к свободным Са2+ в цитозоле, и именно к этим свободным Са2+ Уровень, что Са2+-зависимые и Са2+ферменты отвечают контролируемые. Общего кальция внутри клетки значительно выше, чем 10-7М, но большая часть этого кальция либо связаны с белками, полифосфатом, мембран или другими клеточными составляющие, или поглощенные внутри внутриклеточными органеллами, такие как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и ядра (Irvine, 1986). Стимуляция Са2+ приток через плазму
Мембрана является одним из ключевых событий в сигнализации TRANSMEM-бран. Калифорния2+ органеллы хранения, способные как высокого поглощения сродства и быстрого высвобождение вызвали Са2+Считается, что повсеместно среди эукариот (Carafoli, 1987). В этой главе рассматриваются различные особенности гомеостатических механизмов кальция в токсоплазма, а также методы, используемые в исследовании.
флуоресцентных методов для изучения КАЛЬЦИЯ гомеостаза в Т. гондий
Из-за ее важности, многочисленных методов анализа механизмов клеточного и / или субклеточном Ca2+деятельности были созданы. Несмотря на то, что каждый метод имеет некоторые преимущества по сравнению с
Токсоплазма. Модельные Apicomplexan-перспективы и методы, под редакцией Weiss & Kim
ISBN-13: 978-0-12-369542-0
ISBN-10: 0-12-369542-2
Copyright © 2007 Elsevier Ltd.
Все права воспроизведения в любой форме зарезервированы.
| Калифорния2+ |
246 КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЕ И гомеостаз токсоплазма
другие, каждый из них также страдает недостатками. Исследование [Са2+]ярезко повысили с разви-тия флуоресцентных красителей с высокой чувствительностью Tsien и коллегами (Grynkiewicz и соавт, 1985;. Tsien, 1989). Существуют многие другие методы для измерения [Ca2+]я, в том числе 45Калифорния2+, Микроэлектродов, металл-lochromic показатели и Са2+фото-, чувствительные белки. Например,45Калифорния2+ был использован для измерения
освобождение от микросом тахизоитов (Кини и др., 2005). Однако методы флуоресценции были более широко используются в Т. гондий. Здесь, методы, используемые до сих пор для изучения Са2+ в Toxoplasma суммируются.
10.2.1 Флуоресцентные Ca2 + показатели
В химической флуоресцентные зонды наиболее широко используемые для Ca2+Измерения были разработаны Tsien и коллегами (Grynkiewicz и др., 1985). Эти флуоресцентные Са2+Зонды могут быть разделены на основе того, являются ли они ратиометрическими по сравнению с не-логометрическими показателями (одна длиной волны). Логометрическое изменение показателей демонстрируют в их интенсивности с изменением [Ca2+], И, кроме того, Са2+-бесплатно и Са2+-связанная форма индикатора имеет различные спектры с максимумами друг на разных длинах волн. Этот сдвиг в спектрах используются для расчета соотношения интенсивностей флуоресценции, и это полезно для минимизации влияния артефактов, которые не связаны с изменениями в [Са2+]. Логометрические показатели являются предпочтительными, поскольку измеренным сигнал, выражаются в виде значения отношения, нечувствительно к таким факторам, как концентрации красителя, отбеливание, вариации в клеточной толстой-ности, и неравномерное распределение по всей цитоплазме. Наиболее часто используемые логометрических показатели фура-2 и индо-1, оба доступны от Molecular Probes (Invitrogen). Фура-2 показывает значительный сдвиг в его спектрах возбуждения, но не в его спектре излучения, в то время как наблюдается значительный сдвиг в спектрах излучения индо-1. Для отдельных показателей длины волны, как Fluo-3 или Fluo-4 (также помогли-способных от Molecular Probes) интенсивность флуоресценции наблюдалась является единственным измерением, связанным с [Са2+], И изменения интенсивности, возникающие из факторов, не связанных с изменениями в [Са2+] (Неравномерная загрузка красителя, утечка красителя, фотообесцвечивание,
и изменение объема клеток) может запутать интерпретацию данных интенсивности.
Обычно используемые флуоресцентные индикаторы для Ca2+являются карбоксилатный анионами, которые не могут пересекать липидный бислой, и, как следствие, не проникающие клеток. AM (acetomethoxy) эфирная форма этих показателей, которые незаряженные и гидрофобные, был разработана (Цяня, 1981). Эти формы могут пересекать липидные мембраны и проникнуть в глубь клетки. Эта группа АМ лабильная к ферментативному гидролизу с помощью клеточных эстераз, и он удаляется, чтобы позволить карбоксильным группам в индикаторе толку Са2+, Это Ca2+Форма поликарбоксилата, чувствительная, многозарядная, оказывается в ловушке внутри клетки, и он накапливается до сотни микромолярном концентрации (Takahashi и др., 1999). Это может привести к дополнительной Ca2+буферизация и привести к недооценке Ca2+Переходные процессы. Кроме того, гидролиз группы АМ приводит к образованию формальдегида, которые могут быть токсичными для клеток.
Fura-2 AM-нагруженные клетки были использованы для изучения внутриклеточных запасов кальция в Т. гондиях (Moreno и Zhong, 1996). Кроме того, индо-1 было использовано для анализа распределения кальция в T.gondii, инфицированные клетки (Pingret и др., 1996) и эффекты дитиолов на инфицированные клетки (Стоммел и др., 2001). Fluo-4 был использован для обнаружения Ca2+ изменения, вызванные моторики или крепежного клетка-хозяин (Lovett и Сибли, 2003).
Для фура-2 измерений, возбуждения установлена на уровне 340 и 380 нм и эмиссии при 510 нм. Флуоресценции ответа фуры-2 внутриклеточных Са2+концентра-трация должен быть откалиброван из соотношения значений флуоресценции 340/380 нм после вычитания фоновой флуоресценции клеток при 340 и 380 нм, как описано (Grynkiewicz и др., 1985). CA2+]я рассчитывается путем титрования с различными концентрациями Са2+-EGTA буферы (Moreno и др, 1992;.. Vercesi и др, 1993). Концентрации ионных частиц и комплексов при равновесии вычисляются с использованием итеративной компьютерной программы, как описано ранее (Grynkiewicz и др., 1985).
Fluo-3 является одним из наиболее подходящего Ca2+индикаторы для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии. Поглощение и излучение пики
| МЕТОДЫДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ флуоресценцию КАЛЬЦИЯ гомеостаза в Т. гондий |
Fluo-3 являются 506 и 526 нм, соответственно. Излучение Fluo-rescence возрастает с увеличением [Са2+], И Fluo-3, как сообщается, подвергаются увеличению 40- до 200-кратного флуоресценции после связывания Ca2+(Као, 1994). Fluo-4 представляет собой производное Fluo-3, которые могут быть использованы при более низких концентрациях с более флуоресцентных сигналов.
10.2.2 Манипулирование [Са2 + ]
буфера кальция и ионофоры часто используются для снижения или повышения внутриклеточного или внеклеточного кальция. Цель этих протоколов состоит в изучении Са2+-зависимые клеточные процессы (Kao, 1994).
EGTA обладает высокой селективностью для связывания Ca2+ над Mg2+, И из-за этого он является наиболее часто используемым Са2+буфер. Тем не менее, Са2+-связывающий Activ-ность по EGTA очень зависит от рН, когда используется при физиологическом значении рН. Это происходит потому, что при этих значениях рН EGTA существует в основном в качестве протонированных видов (H2EGTA2-) (Самая высокая рКa8.90 и ево 9.52). После связывания Са2+, 2 Н+будет выпущен, предполагая, что эта реакция должна иметь очень крутой рН зависит-Ence. На самом деле, падение рН от 7,2 до 7,1 изменяет Kd(Са) от EGTA с коэффициентом примерно 1,6. было предложено Подкисление среды высоких уровней EGTA, чтобы нести ответственность за постулируемое требование внеклеточного Ca2+ для вторжения в клетки-хозяева по тахизоитами (Ловетт и Сибли, 2003).
Цяня разработан аналог EGTA, в котором метиленовые связи между атомами кислорода и азота были заменены бензольные кольца с получением соединения под названием ВАРТА (Цяня, 1980). Это соединение имеет значительную более низкую чувствительность, чем рН EGTA при физиологических значениях рН, так как его самой высокой рКaы являются 5,47 и 6,36 (Цяня, 1980). Из-за этого, ВАРТА является менее хлопотно Са2+ буфер для использования - хотя это значительно дороже, чем EGTA.
Для изучения соотношения биологического процесса с изменением внутриклеточного кальция ([Ca2+]я), Это полезно, чтобы иметь возможность блокировать изменение [Са2+]яс хелатор кальция. Самый простой способ ввести дополнительный Ca2+буферная емкость в клетки является нагрузка-ки их BAPTA / AM, в виде сложного эфира BAPTA (Виейра и Moreno, 2000). Клетки могут быть загружены
с АМ-эфиров BAPTA и индикатора кальция одновременно, так как те же условия могут быть использованы (Као, 1994). Этот метод ВАРТА буферизация широко используется для понимания роли кальция в секреции microneme Т. гондий (Каррутерсом и Сибли, 1999), коноида экструзии (Mondragon и Frixione, 1996), планирующего моторики (Ветцель и др., 2004) и вторжение (Виейра и Moreno, 2000). Очень важно, чтобы загрузить клетки ВАРТА аналоги не в состоянии хелат Ca2+, В качестве контроля, что эффект BAPTA из-Са2+комплексообразования, а не из-за токсичности. Аналоги, такие как 'пол-BAPTA' (Vieira и Moreno, 2000) или D-BAPTA (Saoudi и др., 2004), может быть использованы, хотя наполовину ВАРТ в настоящее время не имеется. Важно знать, что ВАРТА может отображать побочные эффекты. Она имеет мощный эффект микротрубочек деполимеризации, и уменьшает пул АТФ из клеток (Saoudi и др., 2004). Важно также, чтобы обеспечить контроль, показывающие, что концентрации BAPTA-AM, используемые способны хелат внутриклеточного Ca2+ (Виейра и Морено, 2000).
В ионофорах Br-А23187 и Ionomycin образует липидные-растворимые комплексы с катионами двухвалентных металлов и повышают проницаемость биологических мембран по отношению к Са2+, Есть существенные различающиеся-личиями в свойствах обоих ионофоров, которые следует учитывать при их использовании в эксперименте. Способность Са2+транспорт обоими ионофоров зависит от рН, и это рН-зависимость отличается (Liu и Hermann, 1978). Транспорт Са2+ от Br-А23187 лучше всего при рН 7,5, в то время как Са2+перевозки иономицина не достигает максимума до рН 9,5. Кроме того, IONO-MYCIN имеет лучшую селективность в отношении Ca2+ над Mg2+, Тогда как Br-А23187 не показывает предпочтения одного катиона над другим (Liu и Hermann, 1978). Оба ионофоры неэффективны в опосредовании Ca2+ транспорт при низкой Ca2+концентрации. Br-А23187 (или иономицин) должен быть использован вместо А23187 для флуоресцентной микроскопии, так как А23187 является флуоресцентным.
На рис 10.1 показана типичная трассировка фура-2-загружен Т. гондий тахизоитов в суспензии в буфере, содержащем 1 мМ EGTA. В этих усло-ций, изменения флуоресценции отражают Ca2+движения из внутриклеточных запасов кальция. Добавление
| КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЕ И гомеостаз токсоплазма | ||||||||||||||||||||
| 0,3 | 100 ± 9 нМ в присутствии 1 мМ внеклеточный | |||||||||||||||||||
| Калифорния2+, Так как обнаружено в фура-2 нагруженных клеток (Moreno | ||||||||||||||||||||
| и Zhong, 1996). Эти концентрации в | ||||||||||||||||||||
| Диапазон наблюдается во многих исследованиях с эукариотической | ||||||||||||||||||||
| a | Клетки (Grynkiewicz и др., 1985). | |||||||||||||||||||
| M | 0.2 | 10.3.1 Са | 2+ | перевозки по | ||||||||||||||||
| ì | НИГ | |||||||||||||||||||
| +2 | плазматическая мембрана | |||||||||||||||||||
| я | ||||||||||||||||||||
| ] | ||||||||||||||||||||
| [Са | б | Калифорния2+ входит в эукариотические клетки через плазму | ||||||||||||||||||
| НИГ | Мембрана через ряд каналов, некоторые | |||||||||||||||||||
| 0,1 | из которых находятся под контролем рецепторов (recep- | |||||||||||||||||||
| ION | ||||||||||||||||||||
| тор управления Са2+ каналы), потенциал по | ||||||||||||||||||||
| плазматическая мембрана (потенциалзависимые Са2+ кана- | ||||||||||||||||||||
| ION | Нелс), а содержание внутриклеточных Са2+ магазины | |||||||||||||||||||
| (Магазин управление Са2+ каналы), тогда как другие | ||||||||||||||||||||
| 4 мин | как представляется, неселективные каналы утечки (Tsien | |||||||||||||||||||
| РИСУНОК 10.1Влияние иономицина и нигерицина | и Малиноу, 1990; Цяня и Цяня, 1990). Там | |||||||||||||||||||
| нет прямого | доказательство рецептора управления | |||||||||||||||||||
| на [Са2+]яиз тахизоитов. Тахизоиты были загружены | ||||||||||||||||||||
| фура 2. Ionomycin (ION; 1 мкМ) или нигерицина | или хранить управление Ca2+каналы. Хотя вольт- | |||||||||||||||||||
| (НИГИ; 1 мкМ) были добавлены, где это указано. Трассировка | зависимые Са2+ каналы были обнаружены | |||||||||||||||||||
| показывает начальное добавление ION с последующим NIG. | в свободной жизни | простейшие, нет таких каналов нет | ||||||||||||||||||
| Трассировка б показывает начальное добавление NIG с последующим | ||||||||||||||||||||
| Сообщалось, в Т. гондий. Тем не менее, последовательность | ||||||||||||||||||||
| от ION. Воспроизводится с разрешения Moreno | ||||||||||||||||||||
| с характеристикой напряжения в зависимости от | ||||||||||||||||||||
| и Чжун (1996), Biochem. J. 313, 655-659. | ||||||||||||||||||||
| кальциевые каналы были обнаружены в Т. гондии | ||||||||||||||||||||
| иономицин показывает значительное увеличение внутриклеточной | (. Чен, 2006) геном (20.m03897) (HTTP: // | |||||||||||||||||||
| кальция, что указывает, что кальций высвобождается из | orthomcl. cbil. upenn. Edu / CGI - бен / | |||||||||||||||||||
| внутриклеточное отделение с нейтральным рН в | OrthoMclWeb.cgi). Предсказанный белок имеет 2247 | |||||||||||||||||||
| цитозоль (эндоплазматический ретикулум). Когда нигерицин является | аминокислоты и 24 трансмембранных доменов. | |||||||||||||||||||
| добавлено после иономицина, второе увеличение cytoso- | Активный экспорт кальция из эукариотической | |||||||||||||||||||
| ЛИК Ca2+ происходит за счет его высвобождения из кислой | клетки осуществляется действием Na+/ Са2+ | |||||||||||||||||||
| Отсек (acidocalcisomes). Похожие результаты | теплообменник и Са2+-АТФазы (PMCA). Есть | |||||||||||||||||||
| наблюдается, если порядок дополнений восстанавливается | нет биохимического доказательства присутствия | |||||||||||||||||||
| (Рисунок 10.1). Нигерицина является калий / протон | Na+/ Са2+ теплообменник в T. гондий, хотя ген | |||||||||||||||||||
| теплообменник, и из-за этого свойства alkalin- | кодирование для белка 501 аминокислот | |||||||||||||||||||
| izes кислотных отсеков, позволяя протоны быть | Недавно были аннотированным как натрий / кальций | |||||||||||||||||||
| выпущенный в обмен на калий. Как след- | теплообменник (25.m01788) (Chen и др., 2006). Тем не мение, | |||||||||||||||||||
| тельность, постулируемый протон / теплообменник кальция | как это происходит с дрожжами, вполне возможно, что этот ген | |||||||||||||||||||
| принимает протоны назад и высвобождает Са2+ в цитозоль. | кодирует Ca2+/ЧАС+ теплообменник, так как есть | |||||||||||||||||||
| нет сообщений о присутствии Na+/ Са2+ теплообменники | ||||||||||||||||||||
| 10.3 РЕГУЛИРОВАНИЯ [Са2+]я | в раннем эукариоте (Позос и др., 1996). | |||||||||||||||||||
| PMCA типа Са2+-АТФазы (TgA1) была | ||||||||||||||||||||
| В Т. гондий | отличающееся тем, эти паразиты, который находится | |||||||||||||||||||
| в плазматической мембране и acidocalcisomes | ||||||||||||||||||||
| CA2+]я в тахизоитов составляет около 70 ± 6 нМ, когда | (Ло и др., 2001) (таблица 10.1; смотри также раздел | |||||||||||||||||||
| измеряют в отсутствие внеклеточного Ca2+ (с | 10.4.4). Са PMCA млекопитающих2+-ATPases являются acti- | |||||||||||||||||||
| CA2+ хелатор EGTA добавляли к среде) и | vated по Са2+ связывающий белок кальмодулин |
| РЕГУЛИРОВАНИЯ [Са2+]я В Т. гондий | |||
| Таблица 10.1 Белки потенциально вовлечены в Са2 + гомеостаз Т. гондий | |||
| Имя / присоединение | Выраженный / функция | ||
| белка | число | подтвердил | Ссылка |
| Плазматическая мембрана- | Tg A1 / AF151372 | Да / Да * | Л и др., 2001 |
| типа Ca2+-АТФазы | |||
| (PMCA) | |||
| Sarcoplasmic- | Tg SERCA1 / AAU93917 | Да / Да * | Nagamune и др., 2005 |
| эндоплазматический | |||
| ретикулум Са2+- | |||
| АТФазы (SERCA) | |||
| Кальмодулин (СаМ) | Tg СаМ / CAA69660 | Да / Да ** | Seeber и др., 1999 |
| калнексину | 583.m05347 | Нет нет | Http: //orthomcl.cbil.upenn. |
| Edu / CGI-BIN / OrthoMclWeb.cgi | |||
| Phosphatidylinositol- | Tg PI-PLC / | Да / Да ** | Fang и др., 2005 |
| фосфолипазы С | AAQ75083 / AAV70738 | ||
| (PI-PLC) | |||
| Натрий / водород, | Tg NHE1 / 858890 | Да нет | Arrizabalaga и др., 2004 |
| exhanger (Na+/ЧАС+ | |||
| обменник) | |||
| 23 К кальций- | Tg DAG1 / A33839 | Нет нет | Cesbron-Delaw и др., 1989 |
| связывания основных | |||
| предшественника антигена | |||
| протеинфосфатазу | Неназванный / AAM97279 | Нет нет | Доступный в NCBI |
| 2B регуляторная | |||
| субъединица (кальциневрин) | |||
| Кальмодулин-домен | Tg CDPK1 / AAG53993 | Да / Да ** | Kieschnick и др., 2001 |
| протеинкиназа 1 | |||
| Кальмодулин-домен | Tg CDPK2 / AAG53994 | Да / Да ** | Kieschnick и др., 2001 |
| протеинкиназа 2 | |||
| Кальмодулин-предметной области | Неназванный / CAD32376 | Нет нет | Доступный в NCBI |
| протеинкиназа | |||
| Другое calmodulin- | 20.m00372; 37.m0003; | Http: //orthomcl.cbil.upenn. | |
| белковый домен | 38.m00014; | Edu / CGI-BIN / OrthoMclWeb.cgi | |
| киназ аннотированные | 42.m03394; | ||
| 49.m05692; | |||
| 541.m00134 | |||
* Функция подтверждается выражением в том же паразита или в гетерологичной системе и корреляции обнаружены между экспрессии фермента и Са2+ транспорт.
** Функция подтверждается выражением и обнаружение активности.
Кроме того, некоторые гены, отвечающий кальций / кальмодулин-зависимых протеинкиназы были аннотированными (https://orthomcl.cbil.upenn.edu/cgi-bin/OrthoMclWeb.cgi).
250 КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЕ И гомеостаз токсоплазма
(САМ), и биохимические данные для СаМого stimu-ушного сообщаются на Ca2+-АТФазы из T. гондия (Бий и др., 2001). Однако, по-видимому, TgA1 отсутствует типичный СаМ-связывающий домен, который мог бы предположить наличие другого домена, способного связывать Кэй. Ген для второго возможного PMCA был найден в геноме гондий Т. (44.m02812) (Chen и др., 2006). Выведенная аминокислотная последовательность (1200 аа) содержит секреторную сигнальную последовательность с предсказанным сайтом расщепления между аминокислотами 40 и 41. Кроме того, этот фермент показывает 45-процентную идентичность с TgA1 (Л и др., 2001).
10.3.2 Са2 + -связывающие белки
После того, как внутри клетки, Ca2+ может либо взаимодействовать с так называемыми растворимыми Са2+-связывающие белки, или стать поглощенным во внутриклеточные органеллы. Некоторые из этих Са2+-связывающие белки, такие как кальмодулина (СаМ), действуют как Са2+рецепторы. Другие белки, по-видимому, действуют как Ca2+-storing устройства (например, calsequestrin, калретикулин семей). Т. гондий СаМ небольшая (16 кДа) кислые кальций-связывающий белок с четырьмя участками кальция-связывающим (EF руки) и высоким уровнем идентичности (92,5 процента) с человеческим кулачком (Seeber и др., 1999) (Таблица 10.1). В результате анализа иммун-ofluorescence с использованием моноклональных Antibod-х годов реактивные против СаМ из разных видов, Т. гондий СаМ был найден в апикальном конце выпущенных тахизоитов (вместе с актином и миозином), а также под мембраной в интра-клеточных паразитов (Pezzella -D'Alessandro и др., 2001). Immunogold электронной микроскопия с использованием моноклональных антител против СаМ млекопитающих подтвердила локализацию СаМого в передней области тахизоитов, вместе с актином (песни и др., 2004).2+]я и стимулируют секрецию microneme (Ветцель и др., 2004).
Два члена кальмодулина-подобный домен протеинкиназ, также известный как кальций-зависит-лор протеинкиназы (CDPKs), были обнаружены в
Т. гондий (Kieschnick и др., 2001) (таблица 10.1). Активность TgCDPK1 является кальций-зависимой, но не требует кулачковыми или фосфолипиды и ингибируется KT5926 в концентрациях, которые блокируют прикрепление паразита к клеткам-хозяевам. В пробирке, TgCDPK1 фос-phorylated три паразита белков, которые мигрировали идентичны трем KT5926-чувствительных phosphopro-teins обнаруженной в естественных условиях. На основании этих результатов, было предложено, что TgCDPK1 играет центральную роль в регулировании Т. гондий подвижности и инвазии хост-клеток (Kieschnick и др., 2001).
23-кД кальций-связывающий белок, названный Р24, был идентифицирован в тахизоитах и показан, что одним из основных компонентов антигена и плотных GRAN-üles (Cesbron-Delauw и др., 1989) (табл 10.1). Никаких исследований не сообщалось о Ca2+-storing белки, как калретикулин или calsequestrin, в Т. гондий. Однако ген калнексину был обнаружен в геноме токсоплазмы (583.m05347) (Chen и др., 2006) (табл 10.1). Кроме того, несколько последовательностей с сходством-КИ были обнаружены в геноме Т. гондий. Они символьные теризуются наличием EF-ручных доменов, но их личность и функция требуют дальнейшего изучения.
КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЯ
Эндоплазматической сети
Большой магазин Ca2+в клетках, как правило, находятся в эндоплазматической сети, с местной ConCentra-Тионом идущего миллимолярными уровнями. Эндоплазматическая сеть также имеет два независимых путь-путь для притока кальция и оттока. Приток катализируется очень хорошо известный Sarco-endoplas-микрометр ретикулума Са2+-АТФазы (SERCA), которые активно транслоцируется два Ca2+для гидролиза одной молекулы АТФ. Доказательства наличия Serca типа Ca2+-АТФазы в T.gondii, впервые была предоставлена экспериментах с использованием Fura-2-загружен тахизоиты, в котором тапсигаргин, очень специфический ингибитор этого насоса при использовании при низких концентра-trations (Thastrup и др., 1990), было показано, что увеличение [ Калифорния2+]яв тахизоитах (Moreno и Zhong, 1996). Молекулярные доказательства присутствия
| КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЯ |
SERCA типа Са2+-АТФазы в T.gondii, было сообщено недавно (Nagamune и Сибли, 2005; Nagume и др., 2005). Ген, кодирующий этот насос был в состоянии дополнить дрожжи с дефицитом Са2+ насосы, что свидетельствует о его функции в качестве Са2+насос, а кодируемый белок имеет Аппар-ЛОР молекулярную массу 120 кДа. Ингибиторы этого насоса в других клетках, таких как тапсигаргин (Thastrup и др., 1990) или артемизинина (Экштайн-Людвига и др., 2003), были способны стимулировать секрецию microneme, процесс, который опирается на повышенные [Ca2+]я (Смотри ниже, в разделе «Ca2+- сигнализации ').
Калифорния2+ освобождение от эндоплазматического ретикулума эукариотических клеток опосредуется Рианодин (RyR) и инозитол-1,4,5-трифосфата (InsP3R) Chan-Нелс. RyR активируются повышением [Са2+]я (Са2+индуцированные Са2+релиз, CICR). Кроме того, существует RyR-подобные каналы, активируемые циклической АДФ-рибоза (cADPR), сфингозин, и отчетливые Са2+-release путь активируется никотиновой кислоты аденин динуклеотид фосфата (NAADP). Т. гондий фосфоинозитидного конкретных фосфолипазы С, фермент, который генерирует вторичные мессенджеры Insp3и диацилглицерол, недавно был клонирован, секвенирован и экспрессии в E.coli, и его enzy-Matic характеристики были исследованы (Fang и др., 2006). InsP3/ Рианодин чувствительных магазины были постулированы присутствовать в Т. гондиях, на основании фармакологических исследований (Ловетты и др., 2002). Лечение с этанолом увеличился Insp3 и [Са2+]я, И этот путь был чувствителен к ингибиторам Insp3R каналов. Т. гондий также ответил на агонист cADPR закрытых каналов, такие как Рианодин и кофеин (Ловетты и др., 2002). Доказательства наличия cADPR циклазы и гидролазы деятельности, эти два фермента, которые контролируют уровни cADPR, было обнаружено недавно (Кини и др., 2005). Т. гондий микрос, которые были загружены с45Калифорния2+ выпустила Ca2+при обработке cADPR и антагонисты RYR 8-бром-cADPR и рутений красный блокировали этот ответ. Хотя Т. Gondii микросомы также ответили на ИНСп3, Ингибирование профили этих каналов кальция высвобождения являются взаимоисключающими (Кини и др., 2005). Хотя нет молекулярных доказательств наличия ИНСпа3R или RYR каналы в Т. гондиях, это может быть из-за отсутствие гомологии
с каналами клеток животных, как это происходит в растениях, которые иначе реагируют на те же самом вторичные мессенджеры (Нагат и др., 2004).
Nucleus
Перенос Са2+через ядерную мембрану является предметом многочисленных споров. Хотя даже белки пронизывают ядерную мембрану через ядерные поры, некоторые авторы показали, что движение Са2+могут быть ограничены и требуют SERCA типа насоса. Ядерная мембрана T.gondii, непрерывно эндоплазматического ретикулума (Hager и др., 1999), и такой же состав в каналах и насосов можно было бы ожидать.
Митохондрии
Митохондрии обладают высокой способностью поглощать Са2+, Хотя при физиологических условиях общее митохондриальной Са2+ уровни и свободный Са2+ отражаю и параллельно цитозольные Са2+, Внутренняя mitochon-drial мембрана обладает uniport носитель для Ca2+, Что позволяет электрогенный запись катиона с приводом от электрохимического градиента, генерируемого дыхания или гидролиза АТФ. Отток кальция, с другой стороны, происходит по другому пути-путем, который, как представляется, катализирует электронейтральный обмен внутреннего кальция путем внешнего натрия или протонами. Биохимические доказательства mitochon-drial Ca2+Поглощение доступно в паразитах малярии (Uyemura и др., 2000), а также предварительное доказательство предполагает наличие механизма uniport в Т. гондиях (Vercesi и Moreno, неопубликованные obser-блюдение). В отличии от митохондрий млекопитающих, где внутриклеточных Са2+ регулирует активность нескольких дегидрогеназ, нет такого Ca2+-regulated дегидрогеназы сообщалось в Т. гондий. На рисунке 10.2 показана схема Са2+ гомеостатические механизмы Т. гондий.
Acidocalcisomes
Большой магазин Ca2+в T.gondii, находится в acidocalcisomes (Moreno и Zhong, 1996;. Бий и др, 1999;. Ло и др, 2001). Это
252 КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЕ И гомеостаз токсоплазма
РИСУНОК 10.2 Схематическое изображение распределения Ca2+в Т. гондий. Калифорния2+ запись проб-умело через Са2+Каналы (1). После того, как внутри клеток, Са2+ может быть перемещен назад к extracel-lular среде с помощью PMCA (плазматической мембраны типа Ca2+-АТФазы) (2). Кроме того, Са2+ будет взаимодействовать с Са2+-связывающий белки или стать поглощенным в эндоплазматический ретикулум (3), митохондрии (4), acidocalcisome (5), или ядра
(6). Эндоплазматический ретикулум содержит Serca (саркоплазматический-эндоплазматический ретикулум Са2+-АТФазы) в то время как митохондрия занимает Ca2+через uniport. Acidocalcisomes имеет PMCA, а вакуолярные H+-PPase и В.Х.+-АТФазы. Калифорния2+по-видимому, свободно диффундировать в ядро. Более подробно обсуждаются в тексте. ER, эндо-плазменное ретикулум; М, митохондрии; N, ядро;ΔΨ, Митохондриальный мембранный потенциал. иллюстрация Шерил Е. Риз. Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.
кислые органеллы кальция хранения, найденные в разнообразных микроорганизмов, от бактерий до человека (Docampo и др., 2005). Они являются символьными теризуются их кислотной природой, с высокой плотность (как в весе и с помощью электронной микроскопии), и высокого содержания пирофосфата, полифосфата (поли P), кальция, магния и других элементов (Docampo и др., 2005). Acidocalcisomes являются Сими-лар к волютину или метахроматической гранул впервые описал почти 100 лет назад (Кунец, 1907) в кокцидиях, и обнаружено в 1966 году в T.gondii, на их способность окрашивать красный цвет при обработке Толуй-обеде синей (метахромазия) (Мир Gutierrez и дель Рей Калеро, 1966). Совсем недавно, они также были названы «черные гранулы» (Бономмы и др., 1993).
Ки