Методы изучения acidocalcisomes

В дополнение к световом и электронно-микроскопических методов, используемых для визуализации acidocalcisomes и описанных выше, спектрофотометрическим методом с использованием Fura-2-паразитов загружены были использованы для обнаружения изменений в acidocalcisome Ca²⁺(Морено и Zhong, 1996;. Родригес и др, 2002). Acidocalcisomal Ca²⁺ высвобождается, когда клетки представляются защелачивающие агентов (NH₄Cl), ингибиторы VH⁺-АТФазы (bafilomycin₁) И Na⁺/ЧАС⁺ (Монензин), и К⁺/ЧАС⁺теплообменники, или при инкубации с ионофорами (иономицин) после их подщелачивания (Moreno и Zhong, 1996). Фосфорные соединения были исследованы³¹Р-ЯМР-спектроскопии (Родригиш и др., 2000;. Moreno и др, 2001), или с помощью биохимических методов (Родригиш и др., 2002). Выделение acidocalci-Somes было сделано с помощью йодиксанол центрифугирования в градиенте с использованием ферментных маркеров (Родригиш и др., 2002). Эта процедура показана на рисунке 10.7. В отличии от процедур, используемых перед тем, чтобы изолировать acidocalcisomes от других клеток, этот метод использовал более низкие концентрации иодиксанола на стадиях градиента, но с образцом добавленного в середине градиента в Йодиксаноле слое 20 процентов, а не прикладывается к вершине градиент без добавления иодиксанола. Этот страт-EGY позволило лучшее разделение acidocalcisomes

258 КАЛЬЦИЯ ХРАНЕНИЕ И гомеостаз токсоплазма

ШЛИФОВАЛЬНЫЕ

ДЛЯ 60S

Тахизоиты лизат переливать

Рисунок 10.7 Схематическое представление процедуры фракционирования, используемой для очистки acidocalcisomes Т. гондий тахизоитов. 15 000×г гранулы применяются в среднем слое на 10-30 процентов Йодиксанола ступенчатого градиента. Вставки справа являются Рентгеновским микроанализом изолированной acidocalcisome, показывающего присутствие углерода, кислорода, магния, фосфора и кальция, а также электронно-микроскопического снимок прямой передачи (ПЭЙ) фракции, показывающего электронно-плотных acidocalcisomes. Bar = 1 мкм. Воспроизведено с Permis-Сьон из Родригиш и соавт. (2002), J. Biol. Химреагент 277, 48 650-48 656.

от призраков, присутствующих в промежуточных гидроразрыва-ций и лучшего восстановления фракции осадка у основания градиента (Родригес и др., 2002).

10.5 Са^{2 +} FUNCTION IN

Т. Gondii

Подвижность

Скольжение моторику зависит на актомиозинового двигателя, и имеет важное значение для активного вторжения в клетки-хозяева Т. гондий (Добровольский и Сибли, 1996). В покадровой микроскопии экспериментах паразитов, нагруженных Fluo-4, было обнаружено, что во время паразита

Подвижность цитозольная уровни кальция прошли периодические повышения (как это происходит в мышечных клетках во время схваток), и что внутриклеточные хранит и не внеклеточного кальция были вовлечены в эти изменения (Ловетт и Сибли, 2003).

Коноида экструзия

Коноида экструзии происходит во время вторжения хозяина и выхода из клеток-хозяев, и стимулируется агентами, которые повышают [Са²⁺]_я, Как иономицин, ионофор А23187 кальция и тапсигаргин (Mondragon и Frixione, 1996;. Монтейр и др, 2001). Ионофор-индуцированный коноид экструзия предотвращается путем предварительной инкубации с тахизоитами

внутриклеточный Са²⁺ хелатор ВАРТА-АМ, но не агентами, которые снижают внеклеточный Ca²⁺, Как EGTA (Mondragon и Frixione, 1996).