1) Использование мутантного варианта дифолатредуктазы.
2) Использование генов множественной лекарственной резистентности (типа mdr 1).
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – это невосприимчивость клеток или организма одновременно к целому ряду лекарственных препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия. Она определяется как снижение чувствительности до такой степени, что клетки способны размножаться при воздействии на них препарата в критической или более высокой концентрации. Развитие МЛУ к используемым лекарственным препаратам является одним из проявлений фундаментального биологического свойства всех живых организмов – приспособления к изменениям условий внешней среды. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ множественны, и лекарственная устойчивость может определяться включением различных биологических систем, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата – от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клеток, индуцируемой веществом. Нередко в клетке включается несколько защитных механизмов, однако чаще всего преобладает какой-то один механизм. Наиболее изученными механизмами, клиническая значимость которых при определенных формах новообразований установлена, являются: активация трансмембранных транспортных белков, выводящих различные вещества из клетки (в частности, Р-гликопротеина – Pgp); активация ферментов системы глутатиона, детоксифицирующей препараты; изменения генов и белков, контролирующих апоптоз и выживаемость клеток. Существует тесная взаимосвязь количественных изменений клеточной популяции и изменений их биологических свойств, одним из которых является лекарственная устойчивость. В активно размножающейся популяции всегда имеется некоторое количество лекарственно-устойчивых мутантов, которые практического значения не имеют, но по мере сокращения популяции, например под влиянием химиотерапевтических препаратов, изменяется соотношение между количеством лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых клеток. В этих условиях происходит размножение главным образом лекарственно-устойчивых клеток, их количество неуклонно возрастает. Итогом такой клональной селекции является поликлоновость опухоли и доминирование наиболее агрессивных клонов. В связи с этим целью настоящего обзора является обобщение данных по основным механизмам развития МЛУ опухолевых клеток при воздействии различных химиопрепаратов.
Р-гликопротеин – основной белок-транспортер множественной лекарственной устойчивости
Р-гликопротеин – крупный трансмембранный белок с молекулярной массой 170 кДа (gp170, Pgp), состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков. Это позволяет считать, что молекула Pgp 12 раз пересекает плазматическую мембрану клетки и имеет два сайта связывания с АТФ, свидетельствующих об энергозависимости функционирования белка. Предполагается, что 12 трансмембранных доменов формируют поры или каналы, через которые Рgp активно выбрасывает вещества, и энергия гидролиза АТФ переносится от двух АТФ-связывающих доменов, обеспечивая работу выбрасывающего насоса.
Рис. 1. Строение Р-гликопротеина
Р-гликопротеин – интегральный белок, имеющий 12 трансмембранных доменов, пронизывающих бислой цитоплазматической мембраны. N- и С-концы белка обращены в цитозоль. Участки Р-гликопротеина на наружной поверхности мембраны гликозилированы. Область между шестым и седьмым доменами имеет центры для присоединения АТФ и аутофосфорилирования.
Активность Р-гликопротеина определяет резистентность опухолевых клеток ко многим противоопухолевым лекарствам (антрациклиновым антибиотикам, алкалоидам растительного происхождения, в частности к винка-алкалоидам, подофиллотоксинам, таксанам и др.), а также ко многим другим веществам – флуоресцентным красителям (бромистому этидию – БЭ), пуромицину, грамицидину D и др.
Р-гликопротеин человека кодируется геном mdr1, принадлежащим к семейству mdr, локализованным в хромосоме 7. К МЛУ может приводить как изменение экспрессии гена mdr1, так и увеличение дозы гена – амплификация участка генома, содержащего ген mdr1, и еще пяти или шести сцепленных с ним генов.
Активность Pgp может быть оценена по степени накопления меченного лекарства (например, 3Н-винбластина) или флуоресцирующего препарата (например, даунорубицина) клетками, а также по степени накопления или по скорости выброса веществ, например, флуоресцентных красителей, субстратов для Pgp (родамина-123).
С помощью гибридизации нуклеиновых кислот показано, что селекция клеток китайского хомячка CHLV-79 RJK на устойчивость к бромистому этидию приводит к амплификации и экспрессии генов семейства mdr, один из которых кодирует трансмембранный Р-гликопротеин, ответственный за понижение содержания БЭ в клетках. Авторы полагают, что амплифицированные копии генов mdr локализуются в тех же участках генома, где локализованы гены mdr дикого типа, и морфологически выявляются в виде гомогенно окрашенной области одной из хромосом, производной хромосомы 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что устойчивость клеток CHLV-79 RJK к бромистому этидию в возрастающих концентрациях достигается в результате как амплификации генов mdr, так и регуляции экспрессии этих генов.
В другой работе в результате многоступенчатой селекции клеток китайского хомячка CHO-K1 на устойчивость к бромистому этидию были получены устойчивые сублинии Cerb-1 и Cerb-2. Показано, что клетки Сerb-1 и Cerb-2 характеризуются множественной лекарственной устойчивостью. С помощью гибридизации нуклеиновых кислот в клетках Cerb-2 обнаружены амплификация и повышенная экспрессия генов семейства mdr. В результате слияния клеток Cerb-2 с клетками китайского хомячка линии CHLV-79 RJK, чувствительными к БЭ, были получены два гибридных клона Hyrb-1 и Hyrb-2. Клетки Hyrb-2 характеризовались такой же устойчивостью к БЭ, как и клетки Cerb-2, у клеток Hybr-1 она оказалась ниже. В клетках Hyrb-2 амплификация и экспрессия генов mdr не отличались от таковых у клеток Cerb-2. В клетках Hyrb-1 амплификации этих генов не обнаружено, хотя уровень экспрессии оказался выше, чем в чувствительных клетках. На основании полученных данных можно предположить, что устойчивость клеток китайского хомячка к БЭ обусловлена амплификацией и повышенной экспрессией генов mdr.
В работе Гринчук и сотрудников исследованы кариотипы клеток китайского хомячка линии CHLV-79RJK и 6 сублиний этих клеток, отобранных на устойчивость к возрастающим концентрациям бромистого этидия, а также количество копий генов mdr в клетках, чувствительных и устойчивых к БЭ. Показано, что устойчивые к БЭ сублинии характеризовались МЛУ. Авторы предполагают, что амплификация генов mdr в устойчивых к БЭ клетках CHLV-79 RJK может рассматриваться как фактор, инициирующий последующую дестабилизацию генома и приводящий в итоге к изменениям в структуре кариотипа.
В настоящее время хорошо известно, что при ступенчатой селекции на устойчивость к некоторым цитотоксическим агентам (растительным алкалоидам и антибиотикам) клетки опухолевых линий in vitro приобретают перекрестную устойчивость к целому ряду цитостатиков, различающихся как по структуре и происхождению, так и по воздействию на разные клеточные мишени. Спектры препаратов, к которым развивается перекрестная устойчивость, а также механизмы, ее обеспечивающие, могут различаться в зависимости от выбора селективного агента.
Исследования генов и путей сигнальной трансдукции, вовлеченных в регуляцию активности Р-гликопротеина, свидетельствуют о том, что данных путей может быть несколько. Так, с использованием введения в клетку промоторной области гена mdr1 в составе конструкции, содержащей ген–репортер, а также в условиях стабильной трансфекции некоторых других генов было показано, что на активность промотора mdr1 или эндогенного гена клеток могут влиять гены р53, ras, raf и гены рецепторов ретиноевой кислоты (RARα и RARβ). На активность гена mdr1 влияют также гены транскрипционных факторов c-fos и c-jun, для которых имеются респонсивные элементы в промоторной области гена mdr1.
В регуляции активности Р-гликопротеина принимают участие протеинкиназа С, протеинкиназа А и, возможно, еще некоторые протеинкиназы. Так, в работе Некрасовой изучалась активность протеинкиназы С в клетках клонов линии CHO-K1, устойчивых к бромистому этидию в концентрациях 1 и 10 мкг/мл. Было обнаружено, что в клетках устойчивых клонов, отличающихся по пролиферативным характеристикам как друг от друга, так и от клеток исходной популяции, активность протеинкиназы С на первом этапе селекции увеличивалась во фракции мембран, а при дальнейшем увеличении устойчивости возрастала как в мембранах, так и в цитозоле. Культивирование устойчивых клеток в присутствии бромистого этидия приводило к увеличению активности фермента.
В опытах с культивируемыми клетками было показано, что процесс, связанный с развитием и становлением МЛУ, может сопровождаться изменениями в клеточной морфологии и физиологии: в частности, изменяются распластываемость клеток, скорость их размножения, внутриклеточный мембранный транспорт, опухолеродность и метастатическая активность резистентных клеток.
Показано, что бутират натрия, гемин, 1-β-D-арабинофуранозилцитозин и эритроидный фактор дифференцировки (EDF) индуцируют эритроидную дифференцировку как в резистентных к винкристину клетках К562, так и клетках родительской линии. Уровень экспрессии mdr -гена в сублинии уменьшался после обработки EDF, но не после воздействия других индукторов. Следовательно, EDF регулирует функцию Р-гликопротеина в винкристин-резистентных клетках. Более того, EDF повышал чувствительность клеток сублинии к агентам множественной лекарственной устойчивости и подавлял экспрессию Р-гликопротеина. Было также показано, что линия К562, резистентная к винбластину, была кросс-резистентна к доксорубицину и этопозиду, но оставалась чувствительной к цитозинарабинозиду, 6-тиохинолину. При этом MDR-фенотип не влиял на уровень синтеза гемоглобина в ответ на гемин, но увеличивал способность клеток дифференцироваться при обработке цитозинарабинозидом. Полученные результаты свидетельствуют, что индуцированная дифференцировка необходима в преодолении MDR-фенотипа.