I. В зависимости от количества.
1. Продукты тонкого биологического синтеза – от 100 кг до 1000 т в год – вакцины, витамины, антибиотики для медицины. основная стоимость связана с очисткой и анализом.
2. Продукты маломасштабного биосинтеза – до 20 тыс. тонн в год – аминокислоты для пищевой промышленности, напитки, продукты получаемые ферментацией, антибиотики для с/х.
3. Крупномасштабный биологический синтез – сточные воды после биологической очистки, биополимеры для отдельных отраслей промышленности – полисахариды для извлечения остатков нефти, выщелачивания Ме из руд. Основное условие - дешевизна. Более 20 тыс. тонн в год.
II. По товарным формам.
1. Биопрепараты – основной компонент – жизнеспособные клетки м/о или др. организмы закваски, бактериальные удобрения.
2. Инактивированная биомасса м/о – белок одноклеточных организмов.
3. Биопрепараты на основе очищенных метаболитов – ферменты, витамины, гормоны, антибиотики.
III. Образование биотехнологических продуктов в зависимости от стадии роста биологических объектов.
1. Первичные метаболиты.
2. Вторичные метаболиты.
Биотехнология наиболее развита в Японии (аминокислоты), США (1-я крупная биотехнологическая компания). В XXI в. ок. 20% продуктов станут продукцией биотехнологии. В РБ биотехнология отнесена к новым высоким технологиям. Это связано с ограниченностью ресурсов, никой энерго- и материалоемкостью биотехнологических производств. Возможностью использования местного сырья, экологичность биотехнологических проектов на фоне радиационного и химического загрязнения.
Основные потребители биотехнологической продукции:
Сельское хозяйство (ветеринария);
Пищевая промышленность;
Химическая промышленность.
Для развития ветеринарии требуется ок. 500 препаратов, ок. 100 получат методами биотехнологии.
Схема биотехнологического производства
Исходное сырье культивирование конечный продукт постеферментативная стадия
↑ (ферментация) (целевой) (конечному продукту придается товарный вид,
(предферментация) ↓ утилизируются отходы производства)
(подогрев, размельчение аппаратура биологические объекты сырья и др.).
Характеристика биологических объектов биотехнологии
Клетки м/о – прокариоты и одноклеточные эукариоты (дрожжи, простейшие, водоросли);
Высшие растения;
Животные;
Вирусы;
Трансгены;
Многокомпонентные системы, представленные клетками или определенными компонентами клеток.
Источники получения биологических объектов:
Коллекции культур;
Образцы природного материала. В этом случае необходимо получить чистую культуру м/о.
Существует 5 стадий биотехнологического производства.
Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.
Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.
На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.
Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза.
3Объекты, методы и продукты биотехнологии, их характеристика, цели применения в пищевой отрасли
4.Особенности хранения и культивирования промышленных штаммов продуцентов.
5 СЫРЬЕВАЯ БАЗА БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнологическое производство должно иметь продуцент, сырье для приготовления питательных сред, оборудование для всех этапов технологического процесса. Типичный элементарный состав микроорганизмов следующий: (в % к весу сухой биомассы) углерод – 50%, азот – 7-12% и микроэлементы. Все клетки содержат также кислород и водород. Среда для выращивания микроорганизмов должна включать элементы, которые входят в состав клеток, и сохранять правильное их соотношение.
Выбор состава питательных сред
Применяемые в промышленности продуценты чаще всего являются хемогетеротрофами. Их потребности в энергии и углероде удовлетворяются простыми сахарами – полупродуктами, например, свеклосахарной или кукурузной мелассой, которая содержит 50 – 70% ферментируемых сахаров, сыворотку, отходы консервной промышленности или неочищенными сахара. Для получения дрожжей используют сульфатно-спиртовую барду – побочный продукт бумажного производства.
Промышленные питательные среды для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям.
Прежде всего, они должны содержать все элементы, необходимые для построения клетки: макроэлементы (углерод, азот, фосфор, железо, кислород, кальций, сера, калий, магний) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, ванадий, хлор, натрий, кремний и др.). Эти элементы должны находится в удобоусвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. В качестве источника углерода могут быть использованы разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Остальные макроэлементы содержатся в неорганических соединениях – солях фосфорной и других кислотах. В питательную среду микроэлементы поступают с органическими субстратами, солями и водой. Факторы роста, в частности, витамины (особенно группы В), вносят в среду в виде чистых веществ или в составе органических субстратов.
Одно из условий качественной питательной среды – влажность не менее 20%.
Концентрация солей в среде должна соответствовать концентрации солей в микробной клетке, то есть обеспечивать изотонию. Для большинства микроорганизмов концентрация солей должна быть 0,5%. Галофильные микроорганизмы,обитающие в средах с высокими концентрациями солей, живут при концентрации солей до 3%.
Окислительно-восстановительный потенциал – мера способности химического вещества присоединять электроны, восстанавливаться (Eh среды) – должен соответствовать потребностям микроорганизма. Рост анаэробных бактерий в стандартной среде подавляется при величинах Eh выше 100 мВ, некоторые виды не растут при Eh выше 330 мВ. Аэробные, микроаэрофильные и факультативно-анаэробные виды имеют оптимальное для себя значение Eh, снижение или превышение его ингибирует их рост. В ограниченных пределах микробы способны изменять Eh в сторону оптимального для них значения. Для создания нужной для роста микроба Eh среду аэрируют или из нее удаляют кислород. Снизить окислительно-восстановительный потенциал можно добавлением восстановителей (0,5% глюкозы, 0,05% натрия тиогликолата, 0,025% цистеина, 0,1% аскорбиновой к-ты).
Концентрация водородных ионов (pH) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (оптимальный диапазон pH 4,5 – 8,5).
Питательная среда должна быть стерильной.
В производстве фармацевтической продукции применяются натуральные, полусинтетические и синтетические питательные среды. Сырьем для натуральных средслужат животные ткани, микроорганизмы, растения, овощи, фрукты, зерно и другие продукты, а также отходы производства. К плюсам использования натуральных сред относится наличие всего комплекса необходимых компонентов, к минусам – малая пригодность для крупнотоннажных производств из-за непостоянства состава. Комплексные натуральные среды, состоящие из пшеничных отрубей и биошрота, широко используются для получения ферментов. Естественные среды, представляющие собой экстракты растительного и животного материала (виноградный сок, молоко, пептон, сыворотку), долгое время были единственными для культивации микроорганизмов и клеток тканей. Подобные среды удобны, так как содержат все источники, необходимые для роста и размножения, имеют неопределенное содержание макро- и микроэлементов.
Полусинтетические среды состоят из соединений известной химической природы и комплекса неопределенных веществ. Это меласса, кукурузный экстракт, отруби, жидкие парафины, древесные гидролизаты и другие отходы пищевых и непищевых производств (антибиотики, аминокислоты, дрожжи, ферменты).
Синтетические среды состоят из химически чистых, строго дозированных веществ, служащих для культивирования микроорганизмов и простейших в лабораторных условиях. Среди таких веществ – соединения известной химической природы: этанола, метанола, природного газа и метана.
6 Принципы выбора сырья и составления питательных сред в биотехнологии.
Питательные среды могут иметь неопределенный состав, то есть включать биогенные добавки - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Применяют также среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях - синтетические среды. Среды обоих типов имеют как преимущества, так и недостатки. С экономической точки зрения наиболее целесообразно употребление более дешевого природного сырья. Применение синтетических сред строго определенного состава позволяет регулировать протекающие в биореакторе процессы, добиваться их оптимизации. Компромиссным подходом является использование полусинтетических сред, в состав которых вместе с соединениями известной химической природы входят биогенные добавки.
Компонентный состав сред зависит от пищевых потребностей микроорганизмов. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Например, автотрофные организмы синтезируют органические вещества клеток из СО2 и Н2О с утилизацией энергии света (фотоавтотрофы) или химических реакций окисления (хемоавтотрофы), поэтому питательные среды для таких микроорганизмов могут не содержать органические соединения. Очень простые по составу среды для культивирования цианобактерий: источником энергии служит свет, углерода - СО2, азота - N2.
Однако во многих биотехнологических производствах используются микроорганизмы, требующие органических источников углерода и энергии (гетеротрофы). Так как микроорганизмы способны ассимилировать любые органические соединения, то потенциальными ресурсами для биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ. При выборе сырья необходимо учитывать его влияние на себестоимость готового продукта, доступность, методы получения, свойства и качественные характеристики.
Потребности микроорганизмов в тех или иных соединениях определяются особенностями данного вида. В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизмов в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки. Среда для выращивания микроорганизмов должна включать элементы, которые входят в состав клеток, и сохранять правильные соотношения этих элементов.
В состав практически любой питательной среды входят такие компоненты, как вода, соединения углерода, азота, фосфора и других минеральных веществ, витамины.
Вода. Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка).
Источники углерода. Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза, за ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут стать источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо если микроорганизмы имеют набор ферментов, гидролизующих эти вещества. Такими микроорганизмами являются плесневые грибы родов Aspergillus, Penicilli-um, бактерии рода Bacillus и др.
На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.
Низкомолекулярные спирты - метанол и этанол - относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и др., бактерии рода Flavobacterium используют в качестве единственного источника углерода метанол.
Некоторые виды микроорганизмов (незначительная часть) используют в качестве источника углерода и энергии углеводороды: н-алканы и некоторые фракции нефти.
Источники азота. Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко усваиваются микроорганизмами.
Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем другие микроорганизмы (грибы, актиномицеты и дрожжи).
Источники фосфора. Фосфор является важнейшим компонентом клетки. Он входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты.
Источники витаминов и микроэлементов. Потребность микроорганизмов в витаминах и микроэлементах различна, тем не менее практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и другие продукты. Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки.
Состав питательной среды для конкретного вида микроорганизма устанавливается экспериментально. Задача специалиста, оптимизирующего состав среды, - выбрать из перечня источников углерода, азота, фосфора и других веществ наиболее оправданные в экономическом и экологическом отношении и внести их в необходимом соотношении.
Питательная среда — однокомпонентный или многокомпонентный субстрат, применяемый для культивирования микроорганизмов или культур клетоквысших организмов.
Требования, предъявляемые к питательным средам
· быть питательными, то есть содержать в легко усваиваемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста — витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать.
· иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — pH, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.
Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5—9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2—6,8).
Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, то есть содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена.
· быть изотоничными для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида.
· быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.
· плотные среды́ должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.
· обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом, то есть соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы — при RH2 не ниже 10.
· быть по возможности унифицированным, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.
Желательно, чтобы среды были прозрачными — удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.
Классификация
· По исходным компонентам:
o натуральные среды — готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, асцит, костная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)
o синтетические среды — готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.
· По степени готовности:
o готовые питательные среды (в чашках Петри, во флаконах)
o сухие смеси
· По консистенции (степени плотности):
o жидкие (бульоны)
o полужидкие
o плотные
Плотные и полужидкие среды отличаются от жидких наличием желирующего агента (агар-агар, реже желатин). Кроме того, в качестве плотных сред применяют коагулировавшие яичные или сывороточные белки, картофель, среды с силикагелем. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается.
· По составу:
o простые: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), питательный желатин,
o сложные — многокомпонентные среды, которые могут содержать аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие вещества.
· По назначению:
o основные — служат для культивирования большинства микроорганизмов, например МПБ, МПА, бульон, шоколадный агар, пептонная вода.
o специальные — служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах.
o
o элективные (избирательные) — служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Среды становятся элективными при добавлении к ним определённых антибиотиков, солей, изменения pH. Жидкие элективные среды называют средами накопления.
o дифференциально-диагностические — позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности.
o транспортные — предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала.
Приготовление сред[
Посуда для приготовления сред [править | править код]
Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке её в ржавых кастрюлях. Лучше пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 минут в 1-2 % растворе хлороводородной кислоты, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.
Сырьё [править | править код]
Исходным сырьём для приготовления большинства сред служат продукты животного и растительного происхождения, а также готовые полуфабрикаты.
Этапы приготовления
1. варка: среды варят на открытом огне, водяной бане, автоклаве или варочных котлах.
2. установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.
3. осветление производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови.
4. фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена — они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
5. разливают среды не более чем на ¾ ёмкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.
6. стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте.
7. контроль
· для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают.
· химический контроль окончательно устанавливает pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов.
· для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды.
9 Мутационная изменчивость, гибридизация микроорганизмов
Мутационная изменчивость. Это естественный фактор эволюции. В популяции клеток в каждом поколении по каждому гену обнаруживается 105 - 107 мутантных клеток. Благодаря спонтанным мутациям микроорганизмы легко приспосабливаются к новым условиям существования. Частота мутаций возрастает после действия мутагенных факторов. Индуцированные мутации позволяют получить биообъект с высокими полезными продуктивными свойствами.
Так, мутанты некоторых прототрофов становятся способными к синтезу необычных продуктов. Так, если Streptomyces grisius синтезирует хлортетрациклин, то мутант полученный на его основе – тетрациклин.
Мутационные изменения приводят к физиологическим и морфологическим изменениям клетки. Поэтому у мутанта становятся иными требования к питательной среде и к условиям культивирования. У суперпродуцентов положительные мутанты встречаются реже, т.к. их геном уже насыщен мутациями.
Отбор положительных мутантов. Для этого проверяют тысячи мутантных культур, используют скрининговые методы или естественный отбор. Например, хересные винные дрожжи (Saccharomyces oviformis), при переокислении спирта образуют продукты, которые придают вину хересный букет. Но такие дрожжи чувствительны к концентрациям спирта выше 15%. Так, при длительном повышении содержания спирта до 18% и пользуясь методом естественного отбора, удалось выделить штамм, который образует херес при повышенных концентрациях спирта.
Положительные мутанты можно выделять успешнее, если знать особенности их метаболизма. При этом можно увеличить частоту получения положительных мутантов путем использования химических или биохимических факторов: селективная детоксикация питательного субстрата; добавление в питательную среду ингибитора целевого продукта; увеличение проницаемости клеточной мембраны; усиление выведения продукта из клетки; использование ауксотрофных мутантов; применение катаболитной репрессии; перевод ферментов из категории индуцируемых в разряд конституционных и т.д.
Так, при селективной детоксикации питательного субстрата токсические вещества взаимодействуют с продуктом сверхсинтеза. В результате детоксицируется субстрат и сохраняется выживаемость мутанта. Так получают бета-лактамные антибиотики, которые комплексируются с ионами тяжелых металлов или с токсическими аналогами аминоксилот.
Гибридизация микроорганизмов. Ранее этот метод селекции применялся редко, так как для микроорганизмов не свойственно скрещивание (половое размножение). Например, при гибридизации грибов используют вегетативную гибридизацию, которая аналогична половому процессу размножения. При этом генетический материал двух вегетативных клеток грибов обменивается при клеточном слиянии (парасексуальный цикл). Этот процесс можно оптимизировать методами клеточной инженерии.
Другой вид гибридизации – слияние протопластов. Протопласты – это клетки, лишенные клеточной стенки. Ее можно удалить следующими способами: выращивание клеток в присутствии антибиотиков, которые препятствуют образованию клеточной стенки; действие ферментом лизоцимом или комплексом ферментов микробного генеза (“дрожжелитин”).
Слиянию протопластов способствуют некоторые стимуляторы (полиэтиленгликоль). В гибридах затем легко образуется нормальная клеточная стенка.
Гибридизация микроорганизмов позволяет:
· интегрировать в одной клетке нужные свойства двух и более штаммов или видов. Так, дрожжи штамма Saccharomyces serevisiaе были скрещены с пивными дрожжами вида Saccharomyces carllsbergensis. Полученный гибрид полностью гидролизовал раффинозу до моносахаридов. Это не было характерно для родительских видов дрожжей;
· отбирать рекомбинанты второго поколения, т.е. после рекомбинации хромосом. При этом появляются клетки с новыми свойствами. Так, пивные дрожжи, сбраживающие сахарозу и мальтозу скрестили с дикими штаммами дрожжей, которые не сбраживали оба дисахарида. Получили гибрид, который не сбраживал сахарозу, но ассимилировал мальтозу. Такие клоны гибридов применяют при изготовлении “бархатного” пива (с несброженной сахарозой) и кваса;
· ввести в геном микроорганизма мутации других штаммов. Это сокращает длительность ступенчатого отбора. Так был получен штамм E. coli для производства треонина;
· инокулировать в бактерию гены, которые не характерны для данного вида или увеличить число уже существующих генов. Это повышает продуктивность микроорганизма по данному гену. Например, в E. coli были введены гены, определяющие синтез амилазы, целлюлазы, сахаразы и т.д.
16 Методы стерилизации питательных сред. Термическая непрерывная и периодическая стерилизация питательных сред
Стерилизация питательных сред.
Стерилизация является заключительной операцией при приготовлении любой питательной среды. Питательные среды после разливки их в сосуды чаще стерилизуют нагреванием — термостерилизацией. Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) с налитыми в них средами закрывают ватными пробкам предохраняющими их в дальнейшем от заражения микробами из вне.
Стерилизация насыщенным паром под давлением. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Автоклав представляет собой двухстенный металлически котел, герметично закрывающийся крышкой. Между стенками котла находится вода. Стерилизуемые объекты ставят на дно автоклава. Автоклав снабжен манометром указывающим давление пара в котле, выпускным краном для выхода воздуха и пара и предохранительным клапаном, обеспечивающим выход пара при превышении заданного давления.
Автоклав обогревается газом или электричеством. Образующийся при кипении воды пар поступает в котел через отверстия, имеющиеся в верхней части его внутренней стенки, и через выпускной края выходит, вытесняя из автоклава воздух. После полного вытеснения воздуха (при этом выделяется сильная сплошная струя пара) выпускной кран закрывают и в автоклаве постепенно повышается давление. Когда оно достигнет 1 атм (по манометру), подогрев регулируют, чтобы поддерживать давление на одном уровне в течение необходимого времени. При таком давлении водяной пар имеет температуру 120° С.
При этой температуре выдерживают питательные среды (если объем их не более 0,5—1 л) в течение 20—30 мин. При таком режиме стерилизации погибают не только вегетативные клетки микроорганизмов, споры плесеней и дрожжей, но и бактериальные споры. По окончании стерилизации выключают источник нагрева, после того как стрелка манометра снизится до нуля, осторожно открывают выпускной кран, чтобы вытеснить из автоклава пар. Крышку автоклава открывают лишь после того, как он охладится.
Стерилизуют в автоклаве воду, мясо-пептонный бульон, дрожжевой автолизат, агаровые и другие среды, которые не претерпевают заметных изменений при темпетуре 120° С.
Стерилизация текучим паром. Эта стерилизация бывает дробной, или последовательной. Она применяется чаще для питательных сред, которые могут заметно изменять свои свойства при стерилизации в автоклаве, например молоко, среды, содержащие сахара, желатин.
Для стерилизации используется аппарат Коха (кипятильник Коха). Он представляет собой металлический цилиндр, покрытый изоляционным материалом, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно цилиндра наливается вода. Над водой располагается металлическая подставка с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые питательные среды.
Вода в аппарате нагревается газом или электричеством до 100°С. Образующийся пар (текучий), прогревает стерилизуемые материалы, выходит через специальное отверстие и неплотности крышки.
Стерилизация производится дробно — в три приема три дня подряд по 30 мин ежедневно. Повторная стерилизация, вызывается тем, что при температуре 100° гибнут не все споры бактерий. В промежутках между нагревами (каждый — раз в сутки) питательная среда выдерживается в термостате при 25° С. За это время оставшиеся живыми споры прорастают в вегетативные клетки, которые и уничтожаются последующим нагревом при 100° С.
Холодная стерилизация (фильтрация). Метод холодной стерилизации применяется для жидких сред, которые не выдерживают нагревания.
Способ заключается в фильтровании сред через специальные мелкопористые бактериологические фильтры, задерживающие микроорганизмы (ультромикробы проходят).
Фильтры изготовляются из различных материалов из фарфоровой глины, асбеста, нитроклетчатки (мембранные ультрафильтры) и др.
17 Важным технологическим процессом в биологических производствах является очистка от механических включений и стерилизация воздуха, используемого для вентиляции цехов и боксов, передачи под давлением стерильных культуральных жидкостей и растворов, поддержания избыточного давления в стерильных емкостях. В значительных количествах стерильный воздух используют для аэрации процесса культивирования. Отводимый из лабораторных и производственных помещений отработанный воздух также подвергается очистке от присутствующих в нем микроорганизмов и контролируется на чистоту.
Основным требованием к техническим системам очистки и стерилизации воздуха является очистка его от микрофлоры и других примесей. Кроме обеспечения этого требования, рассматриваемые системы должны обеспечивать получение воздуха с определенными термодинамическими характеристиками (температура, влажность, давление), от которых, в конечном счете, зависит эффективность работы систем в целом (рис. 1)
Рисунок 1 - Типовая технологическая схема очистки стерилизации воздуха в биотехнологии.
Технологическая схема очистки и стерилизации воздуха осуществляется по следующим стадиям: предварительная (грубая) очистка от механических примесей, сжатие, охлаждение, отделение сконденсированных паров, влаги и масла (при поршневых компрессорах) и собственно стерилизация.
· 1-й этап - грубая очистка. На входе заборника воздуха или другого газа устанавливают, в зависимости от расхода, висциновый фильтр или фильтр Рекка, которые очищают газ от грубых примесей перед компрессором.
· 2-й этап - сжатие газа. В настоящее время в различных отраслях промышленности в основном используются поршневые компрессоры (например, марок ТК-350/5, ТК-300/840, ТКК-1/4 и ТЭ и др.).
Однако более рациональным является применение турбовоздуходувок (например, марки 920-33), что позволяет упростить и улучшить схему газоподготовки. При сжатии воздух нагревается от 100 до 200 °С, поэтому его необходимо охладить до температуры культивирования.
Из-за высокого влагосодержания атмосферного воздуха при охлаждении выпадает 50 - 70 % исходной влаги, которая может увлажнить фильтрующий материал, поэтому воздух после компрессора охлаждают до 25 - 30 °С в охладителе 3, а после отделения влаги во влагоотделителе 4 нагревают в теплообменнике 5 до температуры культивирования в стерильной сушилке между головным и индивидуальным фильтрами или путем подачи пара в рубашку фильтров, если она предусмотрена.
· 3-й этап - первичная очистка и фильтрация газа. После подогревателя газ поступает в первую ступень очистки и фильтрации - головной фильтр.
· 4-й этап - тонкая очистка и фильтрация газа. После головного фильтра газ поступает в индивидуальный фильтр и далее в биореактор.
При использовании турбовоздуходувок схема фильтрации упрощается за счет исключения из нее холодильника и брызгомаслоотделителя.
Для обеспечения эффективности использования нагретого воздуха, следует:
1. Часть воздуха после второй ступени компрессора охладить до температуры ниже точки росы и после влагоотделения в брызгоуловителе поднять его температуру путем смешения с горячим воздухом, отобранным после компрессора (перед воздухоохладителем) до заданного предела.
Предусмотреть для автоматического поддержания температуры на заданном уровне регулятор температуры в комплекте с пневматическим клапаном, установленным на линии подачи горячего сжатого воздуха.
· 3. Учесть, что вариант подогрева воздуха путем его смешения с горячим воздухом можно применить на тех предприятиях, где расстояние от компрессора до головного фильтра не слишком велико (ориентировочно около 100 м). При условии же большей удаленности здания компрессорного цеха от головных фильтров следует производить подогрев воздуха специальным паровым подогревателем, расположенным в непосредственной близости от головного фильтра.
· 4. Учесть, что в зимний период, когда влагосодержание воздуха незначительно, нет необходимости в применении дополнительного подогрева воздуха и система подогрева можно отключить. Режим охлаждения воздуха в воздухоохладителях следует отрегулировать таким образом, чтобы температура его перед индивидуальным фильтром составляла 45 - 50 °С.
Необходимо отметить, что только при соблюдении всех перечисленных выше условий может быть га