Масс-спектрометрию описывали как мельчайшие весы в мире, не из-за размера масс-спектрометра, но из-за того, что он взвешивает – молекулы. За последнее время масс-спектрометрия претерпела потрясающий технологический подъём, позволяющий применять её для белков, пептидов, углеводов, ДНК, лекарств и многих других биологически активных молекул. Благодаря таким способам ионизации, как ионизация электроспрея (ESI) или лазерная десорбция/ионизация из матрицы (MALDI), масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом для биохимических исследований.
Основы масс-спектрометрии
Масс-спектрометр определяет массу молекулы, измеряя отношение массы к заряду (m/z) её иона. Ионы генерируются при потере или получении заряда нейтральными частицами. После образования ионы электростатически направляются в анализатор массы, где они разделяются соответственно своему m/z и, наконец, детектируются. Результатом ионизации молекул, разделения ионов и детектирования ионов является спектр, по которому можно определить молекулярную массу и даже некоторую информацию о строении вещества. Можно провести аналогию между масс-спектрометром и призмой, как показано на рис. 1.1. В призме свет разделяется на компоненты по длинам волн, которые затем определяются оптическим рецептором. Точно так же, в масс-спектрометре сгенерированные ионы разделяются в анализаторе массы, подсчитываются и определяются в детекторе ионов (таких, как, например, электронный умножитель).
Принципиальное устройство масс-спектрометра
Четыре базовых компонента являются стандартными для большей части масс-спектрометров (рис. 1.2): система ввода образца, устройство иониза-
|
|
ции, анализатор массы и детектор ионов. Некоторые приборы комбинируют ввод образца и ионизацию, в других объединены анализатор массы и детектор. Однако все молекулы образца претерпевают одинаковые воздействия независимо от конфигурации прибора. Молекулы образца вводятся через систему впуска. Попав внутрь прибора, молекулы преобразуются в ионы в устройстве ионизации, а затем электростатически переносятся в анализатор массы. Ионы затем разделяются соответственно их m/z. Детектор преобразует энергию ионов в электрические сигналы, которые затем поступают в компьютер.
Способы ввода образца
Ввод образца был одной из первых проблем в масс-спектрометрии. Для проведения анализа масс образца, который первоначально находится при атмосферном давлении (760 Торр), он должен быть введён в прибор таким образом, чтобы вакуум внутри последнего остался практически неизменным (~10-6 Торр). Основными методами ввода образца являются прямое введение
зонда или подложки, обычно используемое в MALDI-MS, или прямое вливание или впрыскивание в устройство ионизации, как в методе ESI-MS. [1]
Прямое введение: использование прямого введения зонда/подложки (рис. 1.3) – очень простой способ доставки образца в прибор. Образец сначала размещается на зонде, а затем вводится в ионизационную зону масс-спектрометра, обычно через вакуумный клапан. Образец после подвергается необходимым процедурам десорбции, таким как лазерная десорбция или прямое нагревание, чтобы обеспечить испарение и ионизацию.
Прямое вливание или впрыскивание: простой капилляр или капиллярная колонка используется для помещения образца в газообразной форме или в растворе. Прямое вливание также удобно, потому что оно позволяет эффективно вводить малые количества вещества в масс-спектрометр без нарушения вакуума. Капиллярные колонки обычно используются для разграничения систем разделения и устройства ионизации масс-спектрометра. Эти системы, включая газовую хроматографию (ГХ) и жидкостную хроматографию (ЖХ), также служат для разделения различных компонентов раствора, важных для анализа масс. В газовой хроматографии разделение различных компонентов происходит в стеклянной капиллярной колонке. Как только пары образца покидают хроматограф, они направляются прямиком в масс-спектрометр.
|
|
90. Принципиальная схема разделения пучка ионов в магнитном и электрическом поле. Масс-спектрометры, приборы для разделения ионизированных частиц вещества (молекул, атомов) по их массам, основанные на воздействии магнитных и электрических полей на пучки ионов, летящих в вакууме. В масс-спектрометрах регистрация ионов осуществляется электрическими методами, в масс-спектрографах — по потемнению чувствительного слоя фотопластинки, помещаемой в прибор.
В основе классификации масс-спектрометров лежит принцип устройства масс-анализатора.Различают статические и динамические масс-спектрометры.В статических масс-анализаторах для разделения ионов используются электрические и магнитные поля, постоянные или практически не изменяющиеся за время пролёта иона через прибор. Разделение ионов является в этом случае пространственным:ионы с разными значениями m/е движутся в анализаторе по разным траекториям. В масс-спектрографах пучки ионов с разными величинами m/е фокусируются в разных местах фотопластинки, образуя после проявления следы в виде полосок (выходное отверстие ионного источника обычно делается в форме прямоугольной щели).В статических масс-спектрометрах пучок ионов с заданным m/е фокусируется на щель приёмника ионов. Масс-спектр образуется (развёртывается) при изменении магнитного или электрического поля, в результате чего в приёмную щель последовательно попадают пучки ионов с разными величинами m/е. При непрерывной записи ионного тока получается график с ионными пиками.Для получения в такой форме масс-спектра, зарегистрированного масс-спектрографом на фотопластинке, используются микрофотометры.
|
|
Рис. 3. Схема статического магнитного анализатора с однородным магнитным полем; S1 и S2 — щели источника и приёмника ионов; ОАВ — область однородного магнитного поля Н, перпендикулярного плоскости рисунка, тонкие сплошные линии — границы пучков ионов с разными m/е; r — радиус центральной траектории ионов.
На рис. 3 приведена схема распространённого статического масс-анализатора с однородным магнитным полем. Ионы, образованные в ионном источнике, выходят из щели шириной S1 в виде расходящегося пучка, который в магнитном поле разделяется на пучки ионов с разными
причём пучок ионов с массой mb фокусируется на щель S1 приёмника ионов. Величина mb/e определяется выражением:
где mb — масса иона (в атомных единицах массы), е — заряд иона (в ед. элементарного электрического заряда), r — радиус центральной траекторииионов (в см), Н — напряжённость магнитного поля (в э), V — приложенная разность потенциалов (в в), с помощью которой ускорены ионы в ионном источнике (ускоряющий потенциал).
Развёртка масс-спектра производится изменением Н или V. Первое предпочтительнее, т. к. в этом случае по ходу развёртки не изменяются условия «вытягивания» ионов из ионного источника. Разрешающая способность такого масс-спектрометра:
(2) где s1 — ширина пучка в месте, где он попадает в щель приёмника S2.
Если бы фокусировка ионов была идеальной, то в случае масс-анализатора, у которого X1 = X2 (рис. 3), s1 было бы в точности равно ширине щели источника S1. В действительности s1>S1, что уменьшает разрешающую способность масс-спектрометра.Одной из причин уширения пучка является разброс в кинетической энергии у ионов, вылетающих из ионного источника.Это в большей или меньшей степени неизбежно для любого ионного источника (см. ниже). Другими причинами являются: наличие у данного пучка значительной расходимости, рассеяние ионов в анализаторе из-за столкновения с молекулами остаточного газа, «расталкивание» ионов в пучке из-за одноимённости их зарядов. Для ослабления влияния этих факторов применяют «наклонное вхождение» пучка в анализатор и криволинейные границы магнитного поля.В некоторых масс-спектрометрах применяют неоднородные магнитные поля, а также т. н. призменную оптику (см. Электронная и ионная оптика).Для уменьшения рассеяния ионовстремятся к созданию в анализаторе высокого вакуума (£10-8 мм рт. cm. в приборах со средней и высокой величиной R).Для ослабления влияния разброса по энергиям применяют масс-спектрометры с двойной фокусировкой, которые фокусируют на щель S2 ионы с одинаковыми m/е, вылетающие не только по разным направлениям, но и с разными энергиями.Для этого ионный пучок пропускают не только через магнитное, но и через отклоняющее электрическое поле специальные формы (рис. 4).
Рис. 4. Пример масс-анализатора с двойной фокусировкой. Пучок ускоренных ионов, вышедших из щели S1 источника ионов, последовательно проходит через электрическое поле цилиндрического конденсатора, который отклоняет ионы на 90°, затем через магнитное поле, отклоняющее ионыещё на 60°, и фокусируется в щель S2 приёмника коллектора ионов.