АО представляет собой метахроматический флуорохром, т.е. он способен менять свой спектр люминесценции от зеленой (lmax = 530 нм) до красной (lmax = 640 нм) в зависимости от физико-химического состояния, иными словами, от того, в какой форме он находится - в виде мономеров или димеров (полимеров). В фиксированных клетках АО связывается с НК2 (ДНК) в форме мономеров (интеркалирует) и люминесцирует с высоким квантовым выходом в зеленой области спектра, а с НК1 (РНК) он связывается в форме димеров и полимеров (стэкинг-взаимодействие) и люминесцирует уже в красной области спектра.
Иногда, в условиях структурной нестабильности хроматина, например при хронической патологии, повреждающем воздействии на клетку или искусственной депротеинизации ДНП, АО способен генерализованно денатурировать ядерную ДНК иммуноцитов крови in situ (на месте), переводя ее из двуспиральной формы в форму однонитевого клубка с соответствующими спектральными изменениями в эмиссии клеток.
При хронической патологии, в условиях перманентной стимуляции иммуноцитов, они могут перейти в состояние ареактивности или функционального срыва, что делает невозможным их дальнейшие физиологические ответы. Выделенные из такого организма иммуноциты практически не реагируют на митогены, но, если судить по изменениям их люминесцентных характеристик, воспринимают воздействие ИЭМК, реализующееся в виде перехода.в состояние, более близкое по люминесцентным параметрам к норме. Иными словами, не исключено, что ИЭМК в отношении иммуноцитов крови обладает свойствами не просто стимулирующего, а, возможно, нормализующего или оптимизирующего характера. Этому есть и другие подтверждения, приведенные ниже.
|
|
Иммуноциты крови онкологических больных значительно отличались по своим люминесцентным характеристикам не только от аналогичных клеток здоровых людей, но и других больных, что уже изначально выражалось в специфическом их отражении на фазовой плоскости (см. рис.3, г). Они слабо отвечали, или вообще не реагировали, особенно на поздних стадиях болезни, на ФГА и Кон А. У них не наблюдалось образования на мембранах ни "кэпов", ни "пэтчей", типичных для реакции лимфоцитов на меченый лиганд (например, ФГА-ФИТЦ) в нормальных условиях. Но они отвечали на воздействие ИЭМК, сходным образом отвечали на раково-эмбриональный антиген (РЭА) и начинали реагировать на ФГА-ФИТЦ после предварительной обработки ИЭМК и 60 мин инкубации (рис. 13). Эти данные свидетельствуют, что ИЭМК действует на иммуноциты и на уровне клеточных мембран, модифицируя их физико-химическое состояние. Можно предполагать, по меньшей мере, повышение текучести мембран, что способствует эффективному протеканию реакции рецептор-лиганд на поверхности клеток. Очевидно с данным фактом связано и некоторое повышение адгезивных свойств и фагоцитарной активности нейтрофилов после обработки ИЭМК (рис. 14).
Как известно, антигенное воздействие как in vivo, так и in vitro на сенсибилизированные иммунокомпетентные клетки может индуцировать у них или митогенный/дифференцировочный ответ, или, совместно с гормональными стимулами, активизировать специфическую функциональную деятельность, что соответствующим образом отражается на их биохимических, морфологических, адгезивных и люминесцентных характеристиках. Примененный в данном случае для постановки реакции in vitro полиспецифичный РЭА был получен лабораторным путем по традиционной технологии при искусственном прерывании беременности (рабочая концентрация антигена составила около 0,5 мг/мл по белку). Попутно подчеркнем здесь тот факт, что на данный антиген достоверно реагировали в не менее чем 50% случаев иммуноциты носителей злокачественных опухолей, некоторых доброкачественных, но не иммуноциты беременных женщин (у которых предполагалась иммунная сенсибилизированность к РЭА) или больных с другой патологией.
|
|
Оппозитное действие ИЭМК оказала на иммуноциты больных с острыми заболеваниями (рис. 15). Из чего, собственно, и можно заключить, что, по-видимому, в отношении уже активированных и находящихся на пике функциональной активности клеток ИЭМК обладает нормализующим или "тормозящим" биологическим эффектом. Об этом, возможно, свидетельствует еще один факт.
На рис. 16 приведены характерные фазовые траектории, описывающие фотодинамический эффект в субстрате (ДНП-АО) в интактных и обработанных ИЭМК иммуноцитах крови здоровых лиц и больных с острой и хронической патологией при облучении живых флуорохромированных АО клеток возбуждающим эмиссию светом в близкой (lв = 390 нм) УФ-области спектра в течение 60 с. Как видно из кинетик, процессы "фединга" в рассмотренных случаях разыгрываются по различным, но типовым сценариям. Данный факт, очевидно, обусловлен особенностями физико-химического состояния ДНП в этих клетках, поскольку выявлены определенные закономерности в характере фотодеструкции исследуемого материала. Это при том, что флуорохромирование клеток и процедуру регистрации бипараметрических кинетик фотовыгорания красителя осуществляли в идентичных условиях. Для нас здесь главное то, что фазовые траектории, описывающие фотодеструкцию субстрата после воздействия ИЭМК, например, у иммуноцитов больных с хронической и острой патологией практически зеркально противоположны. Фотофизические и фотохимические особенности этого феномена еще требуют изучения.
|
|
Таким образом, установлена реакция и ее вариации у иммунокомпетентных клеток крови на воздействие ИЭМК in vitro в условиях нормы и патологии. Однако, планируемый перевод настоящих исследований в плоскость практической реализации для медицинских нужд требует дальнейшей разработки этого вопроса. В частности, относительно общих и специальных механизмов активации иммунокомпетентных клеток. Проведение подобных исследований обычно начинается с опытов in vitro, которые предшествуют попыткам рационального применения новых знаний. Изучение феноменологии и механизмов активации иммуноцитов преследует несколько целей. Одна из них - оценка исходного состояния популяций иммунокомпетентных клеток, особенно в клинических условиях. Вторая - установление корреляций между характером ранних и последующих изменений в иммунокомпетентных клетках при воздействии того или иного активатора в различных условиях. Третья - отыскание путей к управлению поведением иммунокомпетентных клеток.
Иммунная система, как известно, самым непосредственным образом обеспечивает и контролирует адаптивные и восстановительные процессы в организме. Поэтому, циркулирующие в кровотоке клетки иммунной системы, выполняя в организме "цензорные" и гомеостатические эффекторные функции, могут одновременно еще служить тем "зеркалом" (т.е. выполнять "репортерные" функции), в котором отражаются практически все адаптационные и патологические перестройки организма. Даже выделенные из организма иммунокомпетентные клетки крови сохраняют те структурно-функциональные особенности, которые были определены им in vivo их клеточным и гуморальным микроокружением. Можно попытаться использовать это свойство "отражения действительности" иммуноцитов для направленной иммунокоррекции при патологии, например, путем экстракорпорального электромагнитного воздействия (в данном случае импульсных электромагнитных колебаний) на них, и их возвращения обратно в организм. Более того, учитывая многофункциональность иммунной системы, можно ожидать при этом и более широких физиологических сдвигов в организме, что, вероятно, повысит терапевтическую целесообразностью подобного воздействия. Основания для таких ожиданий имеются.
Рис.1. Распределение на фазовой плоскости бипараметрических флуоресцентных сигналов популяций живых иммуноцитов (лимфоцитов и лейкоцитов) крови в норме (а), при остром воспалительном процессе (б) и хроническом воспалительном процессе.
Ось абсцисс (Х) - интенсивность флуоресценции клеток на длине волны 530 нм.
Ось ординат (Y) - интенсивность флуоресценции клеток на длине волны 640 нм.
Дополнительно даны гистограммы распределения значеий Y/X. Данные получены с помощью прграммы "MICROFLU".
Двухволновая микрофлуориметрия. Флуорохромирование АО при рН = 7,2.
Рис.2. Функциональные состояния организма человека, распознаваемые экспертной системой по характеру распределения на фазовой плоскости флуоресцентных сигналов витально флуорохромированных АО иммуноцитов крови.
Рис. 3. Примеры распределений на фазовой плоскости в координатах I530 (X, ось абсцисс) и I640 (Y, ось ординат) бипараметрических флуоресцентных сигналов живых иммуноцитов крови, соответствующих состоянию нормы (а), острого патологического процесса (б), хронического патологического процесса в состоянии ремиссии (в) и опухолевого (гиперпластического) процесса (г).
Эллипсами обозначены распределения лейкоцитов (верхний эллипс) и лимфоцитов (нижний эллипс) в исследуемом случае и в норме (для сравнения). Обработка данных произведена с помощью программы "MEGO".
Рис. 4.
Рис. 5. Динамика спектров люминесценции дрожжей Sacch. cerevisiae в процессе выхода из анабиоза после облучения ИЭМК. 1 – начало инкубации; 2 – 20 мин инкубации; 3 – 40 мин инкубации. Витальное флуорохромирование АО. Ось абсцисс – длина волны в нм. Ось ординат – интенсивность люминесценции. Спектры нормированы
Рис. 6. Сравнение морфологических и спектрально-люминесцентных характеристик дрожжей Sacch. Cerevisiae, инкубированных 72 ч в растворе 5% - сахарозы на обычной водопроводной воде (а) и облученной в ИЭМК (б).
а – большинство дрожжевых клеток находится в состоянии анабиоза;
б - большинство дрожжевых клеток находится в физиологически активном состоянии.
Препараты живых клеток. Флуорохромирование АО при рН = 7,2.
Ось X – интенсивность флуоресценции I530;
ось Y – интенсивность флуоресценции I640;
ось Z – размер клеток в мкм.
Рис. 7. Изменение биосинтетической активности дрожжей Sacch. cerevisiae после воздействия ИЭМК.
Фазовые плоскости в координатах интенсивностей люминесценции I530 (абсцисса) и I640 (ордината) и гистограммы распределения значений параметра a: а – контроль; б – после воздействия ИЭМК.
Фиксация Карнуа. Флуорохромирование АО при РН=4,2.
Двухволновая микрофлуориметрия.
.
Рис. 8. Спектры флуоресценции живых лимфоцитов крови здорового человека (1) и хронического больного (2) до (а) и после (б) воздействия ИЭМК.
Ось абсцисс - длина волны в нм; ось ординат - интенсивность флуоресценции. Флуорохромирование АО при рН = 7,2.
Рис. 9. Изменение флуоресценции популяций живых иммуноцитов крови здорового человека после воздействия ИЭМК.
а - исходное состояние; б - после воздействия ИЭМК.
Фазовые плоскости и гистограммы распределения значений Y/X. Обозначеия как на рис.1. Пояснения в тексте.
Рис. 10. Изменение флуоресценции популяций живых иммуноцитов крови хронического больного после воздействия ИЭМК.
а - исходное состояние; б - после воздействия ИЭМК.
Фазовые плоскости. Данные обработаны по программе "MEGO". Пояснения в тексте.
Рис. 11. Спектры флуоресценции фиксированных лимфоцитов крови здорового человека (1) и хронически больного (2) без воздействий (а), после воздействия ИЭМК (б) и после воздействия ФГА (в). Фиксация Карнуа. Флуорохромирование АО при рН = 4,2.
Ось абсцисс – длина волны в нм; ось ординат – интенсивность флуоресценции.
Рис. 12. Изменение флуоресценции популяции фиксированных лимфоцитов крови здорового человека (верхний ряд) и больного с хронической патологией (нижний ряд) после воздействия ИЭМК и ФГА:
а, г - исходное состояние; б, д - после воздействия ИЭМК; в, е - после воздействия ФГА.
Фазовые плоскости. Наклонной линией показана ось распределения значений параметра a лимфоцитов крови в норме. Ось абсцисс – интенсивность флуоресценции I530; ось ординат – интенсивность флуоресценции I640.
Фиксация Карнуа. Флуорохромирование АО при рН = 4,2.
Рис. 13. Изменение флуоресценции популяций живых иммуноцитов крови онкологической больной (Cr. молочной железы II ст.) после воздействия ИЭМК и РЭА: а - исходное состояние; б - после воздействия ИЭМК; в - после воздействия РЭА.
Витальное флуорохромирование АО. Двухволновая микрофлуориметрия. Ось абсцисс – интенсивность флуоресценции I530; ось ординат – интенсивность флуоресценции I640. Эллипсами на фазовой плоскости обозначено распределение флуоресцентных сигналов лимфоцитов (нижний эллипс) и лейкоцитов (верхний эллипс) в норме.
Рис. 14. Фагоцитоз нейтрофилами крови относительно здорового человека дрожжей S. cerevisiae до (а) и после (б) воздействия ИЭМК. Витальное флуорохромирование АО. Цифровая микроскопия.
Рис. 15. Изменение флуоресценции живых иммуноцитов крови больного с острой патологией после воздействия ИЭМК:
а - исходное состояние; б - после воздействия ИЭМК.
Обозначения на фазовых плоскостях как на рис.3.
Рис. 16. Фазовые траектории изменения флуоресценции живых иммуноцитов крови в норме и при патологии под влиянием возбуждающего излучения без воздействия (верхний ряд) и после воздействия импульсных электромагнитных колебаний (нижний ряд):
а, г - в норме; б, д - при хронической патологии; в, е - при острой патологии.
1 – полиморфноядерные лейкоциты; 2 – лимфоциты; + – конец траектории.
Флуорохромирование АО. Длина волны возбуждающего света - 390 нм. Время облучения – 1 мин.