Глава 2. «Чувство кворума».

Кворум сенсинг, «чувствование (ощущение) достаточности» (quorum sensing) [лат. quorum (praesentia sufficit) — которых (присутствия достаточно); англ. sence — чувство, ощущение] — способность некоторых микробных процессов реализовываться только при наличии достаточной плотности микроорганизмов (кворума) в биофильмах, в популяции кишечных патогенов пищеварительной системы животных и др.; обеспечивает координированное коллективное поведение популяции этих микроорганизмов. [2]

В настоящее время широко распространено мнение, что бактериальные клетки живут не в виде изолированных единиц, а существуют в качестве сообществ, которые используют сложные системы межклеточной коммуникации для лучшей приспособленности к меняющимся условиям окружающей среды. Многоклеточные организмы координируют свою деятельность и развитие посредством сложных взаимодействий составляющих их клеток. В настоящее время становится понятным, что и прокариотические одноклеточные организмы используют принципиально схожую, но свою систему координации деятельности клеток в популяциях, реализующуюся через диффундирующие и ассоциированные с клеткой сигнальные молекулы.

Прокариоты используют сложные сигнальные механизмы для адаптации к изменениям окружающей среды, в том числе к изменению рН, температуры, осмотического давления и доступности питательных веществ. К таким механизмам относится двухкомпонентная сигнальная система, состоящая из белкового сенсора, который детектирует внешний сигнал, и регулятора ответа, который контролирует экспрессию части генов, усиливая таким образом адаптационный ответ. Передача сигнала и регуляция генов осуществляется путем фосфорилирования двух регуляторных компонентов. Такой общий тип сенсорных систем является наиболее хорошо изученным в настоящее время. Однако существует альтернативная сигналпроводящая система, не использующая для своего функционирования перенос фосфата. В данном случае контроль регуляции генов осуществляется посредством небольших диффузионных молекул, к которым применяют термин аутоиндукторы или феромоны. Такие сигнальные молекулы позволяют индивидуальным бактериальным клеткам начать совместное действие только тогда, когда будет достигнута пороговая плотность бактериальной популяции или кворум. Для описания способности определенных бактерий отслеживать собственную популяционную плотность и модулировать экспрессию соответствующих генов был предложен термин quorum sensing или эффект кворума.

Кворумные регуляторные системы основаны на действии двух основных компонентов: низкомолекулярной диффузионной сигнальной молекулы, концентрация которой увеличивается в соответствии с ростом популяции, и белкового фактора транскрипции, который при взаимодействии с сигнальной молекулой активирует транскрипцию соответствующих генов. Известно несколько различных примеров кворумных сенсорных систем, использующих диффузионные сигнальные молекулы. Кворумные системы, основанные на действии ацилированных гомосеринлактонов (АГЛ), распространены исключительно среди грамотрицательных бактерий и являются наиболее хорошо изученными.

Эффект кворума был впервые обнаружен у морских биолюминесцирующих бактерий Vibrio fischeri и V.harveyi. В 1970 году Нельсон с соавторами сообщили, что V. ficsheri продуцирует внеклеточный фактор, аутоиндуктор, который регулирует продукцию люциферазы – отвечающего за биолюминесценцию фермента. В 1981 г. было продемонстрировано, что аутоиндуктором является N-3-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактон (оксогексаноил-ГЛ). Дальнейшее обнаружение кворумных сенсорных систем, основанных на действии АГЛ, у условно патогенных для человека бактерий Pseudomonas aeruginosa и у растительных патогенов Erwinia carotovora и Agrobacterium tumefaciens позволило считать, что данное явление распространено более широко. В настоящее время обнаружено более пятидесяти видов микроорганизмов, продуцирующих АГЛ. Очень часто регулируемые с помощью АГЛ гены связаны с взаимодействием с эукариотическим хозяином. Очевидно, что основанная на действии АГЛ регуляция зависимых от плотности процессов является высоко консервативной системой, распространенной среди Proteobacteria.

Физиологические процессы, регулируемые посредством АГЛ, у различных видов могут варьировать достаточно широко (1).

Как упоминалось выше, передача сигнала с помощью АГЛ была впервые обнаружена у бактерий V. fischeri, и в настоящее время данная сенсорная система является моделью при изучении эффекта кворума. V. fischeri является симбиотическим организмом, колонизирующим световые органы некоторых костных рыб и моллюсков. Сигнальной молекулой, участвующей в регуляции процесса биолюминесценции, в данном случае является оксогексаноил-ГЛ, синтезируемый с помощью LuxI-синтазы. Гомосеринлактоны способны свободно диффундировать через клеточную стенку, периплазму и цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки. Проникнув внутрь, оксогексаноил-ГЛ объединяется с цитоплазматическим белком LuxR в комплекс, который связывается с промоторным участком lux -оперона и активирует его транскрипцию. Гены luxI и luxR являются частью этого оперона, и, таким образом, имеет место механизм позитивной регуляции по типу обратной связи. Остальные гены lux -оперона кодируют ферменты и субстраты, необходимые для процесса биолюминесценции.

Впервые структура АГЛ была идентифицирована в 1981 году. В настоящее время с помощью различных биохимических методов определена структура более десяти АГЛ, продуцируемых бактериями различных видов. Все АГЛ имеют в составе молекулы гомосеринлактоновое кольцо, однако ацилированные боковые цепи различных АГЛ значительно отличаются по длине, степени замещенности и насыщенности.

Общая гидрофобность молекулы представляет собой баланс между некоторой гидрофильностью гомосеринлактонового кольца и гидрофобностью боковой цепи. Такая амфипатическая структура, возможно, позволяет АГЛ проникать через фосфолипидный бислой мембраны и, кроме того, существовать во внутри- и внеклеточных водных средах. Все идентифицированные АГЛ имеют в боковой цепи от 4 до 14 атомов углерода и количество их кратно двум (С6, С8, С12). В целом именно длина боковой цепи и химическая модификация в β-позиции обеспечивают высокую специфичность кворумных сенсорных систем.

В 1985 г. Каплан и Гринберг на бактериях V. fischeri показали, что радиоактивно меченный оксогексаноил-ГЛ быстро диффундирует как внутрь, так и из бактериальной клетки и что на перенос молекул влияет в большей степени концентрация оксогексаноил-ГЛ по разные стороны бактериальной оболочки. Считается, что АГЛ других бактерий также пересекают бактериальную оболочку путем диффузии. Общее наблюдение, что гомологи белка LuxR могут быть активированы путем экзогенного добавления АГЛ из гетерологичных хозяев, свидетельствует в пользу трансмембранного транспортного механизма путем пассивной диффузии. Однако более гидрофобные молекулы с большей длинной боковой цепи (8-14С) будут менее растворимы в цитоплазме и могут концентрироваться в мембранном бислое. Для P. aeruginosa показано, что белки MexAB-OprD выводящей системы играют определенную роль в транспорте оксододеканоил-ГЛ из клетки, но не в поступлении сигнала от бутаноил-ГЛ, который имеет более короткую боковую цепь. Комплекс MexAB-OprD является транспортером для гидрофобных молекул из фосфолипидного бислоя. Пока неясно, связано ли высвобождение других молекул АГЛ с какими-либо энергозависимыми помпами.

Синтез молекул АГЛ у V. fischeri осуществляется с помощью LuxI-синтазы. Анализ синтеза других молекул АГЛ у различных бактерий четко продемонстрировал, что для этого необходимо присутствие белков LuxI-типа. Субстратами для синтеза АГЛ являются молекулы S-аденозилметионина (SAM) и биосинтетические предшественники жирных кислот, синтезируемые при участии ацил-ацилпереносящего белка (ACP). Показано, что все гомологи LuxI-белка катализируют реакцию образования АГЛ. Фермент катализирует реакцию образования амидной связи между ацилированной боковой цепью и аминогруппой SAM. Поскольку образуется множество АГЛ с отличающимися структурами боковых цепей, то гомологи LuxI-белка должны распознавать различные коньюгаты ацил-ACP. Выяснено, что аминоконцевой домен молекулы является высоко консервативным и содержит 10 аминокислотных остатков, полностью гомологичных у различных белков LuxI-типа. Среди этих десяти консервативных аминокислот 7 является заряженными. Исходя из данных, что карбоксиконцевой домен является более вариабельным у различных представителей LuxI-белков, сделано предположение, что именно он обеспечивает распознавание различных ацилированных цепочек в молекулах ацил-ACP. Кроме того, анализ нескольких мутантных белков LuxI-типа позволил идентифицировать положение аминокислотных остатков, имеющих существенное значение для функциональной активности белка. Так, мутации, приводящие к полному отсутствию функциональной активности LuxI-белков, затрагивают область с 25 по 70 аминокислотный остаток; на основании чего можно сделать вывод о том, что эта область отвечает за ферментативную активность белка, а именно за формирование амидных связей. Анализ точечных мутантов показал, что по всей длине молекулы белка имеются консервативные остатки. С помощью сайт-направленного мутагенеза было продемонстрировано, что остатки цистеина в LuxI-белке не имеют значения для его функциональной активности, но важны для проявления функциональной активности у RhlI-белка Р. aeruginosa и TraI-белка Agrobacterium tumefacien.

Помимо LuxI-синтазы у V. fischeri идентифицирован белок AinS (46 кДа), который не гомологичен LuxI, но имеет 34% гомологию с С-терминальным доменом LuxM-белка V. harveyi (25 кДа), который осуществляет позитивную регуляцию биолюминисценции у данного микроорганизма. Продуктом LuxM-синтазы является гидроксигексаноил-ГЛ. AinS-синтаза отвечает за продукцию октаноил-ГЛ. В настоящее время показано, что обе кворумные системы последовательно индуцируют биолюминесценцию и необходимы для успешной колонизации световых органов моллюсков. На ранних стадиях процесса колонизации LuxO-белок репрессирует экспрессию генов, ответственных за биолюминесценцию. LuxO ингибирует транскрипцию litR -гена, кодирующего активатор транскрипции lux -оперона и luxR-гена. При достижении плотности 10⁸ кл/мл синтезируемый с помощью AinS сигнал оказывает двойной эффект: во-первых, индуцирует биолюминесценцию в результате прямого связывания с LuxR и инактивирует LuxO, и, во-вторых, усиливает транскрипцию litR -гена. В свою очередь, LitR-белок позитивно влияет на транскрипцию luxR, что при увеличении плотности популяции усиливает биолюминесценцию, регулируемую кворумной сенсор ной системой LuxI-LuxR.

Впервые структура АГЛ была идентифицирована в 1981 году. В настоящее время с помощью различных биохимических методов определена структура более десяти АГЛ, продуцируемых бактериями различных видов. Все АГЛ имеют в составе молекулы гомосеринлактоновое кольцо, однако ацилированные боковые цепи различных АГЛ значительно отличаются по длине, степени замещенности и насыщенности.

Общая гидрофобность молекулы представляет собой баланс между некоторой гидрофильностью гомосеринлактонового кольца и гидрофобностью боковой цепи. Такая амфипатическая структура, возможно, позволяет АГЛ проникать через фосфолипидный бислой мембраны и, кроме того, существовать во внутри- и внеклеточных водных средах. Все идентифицированные АГЛ имеют в боковой цепи от 4 до 14 атомов углерода и количество их кратно двум (С6, С8, С12). В целом именно длина боковой цепи и химическая модификация в β-позиции обеспечивают высокую специфичность кворумных сенсорных систем.

В 1985 г. Каплан и Гринберг на бактериях V. fischeri показали, что радиоактивно меченный оксогексаноил-ГЛ быстро диффундирует как внутрь, так и из бактериальной клетки и что на перенос молекул влияет в большей степени концентрация оксогексаноил-ГЛ по разные стороны бактериальной оболочки. Считается, что АГЛ других бактерий также пересекают бактериальную оболочку путем диффузии. Общее наблюдение, что гомологи белка LuxR могут быть активированы путем экзогенного добавления АГЛ из гетерологичных хозяев, свидетельствует в пользу трансмембранного транспортного механизма путем пассивной диффузии. Однако более гидрофобные молекулы с большей длинной боковой цепи (8-14С) будут менее растворимы в цитоплазме и могут концентрироваться в мембранном бислое. Для P. aeruginosa показано, что белки MexAB-OprD выводящей системы играют определенную роль в транспорте оксододеканоил-ГЛ из клетки, но не в поступлении сигнала от бутаноил-ГЛ, который имеет более короткую боковую цепь. Комплекс MexAB-OprD является транспортером для гидрофобных молекул из фосфолипидного бислоя. Пока неясно, связано ли высвобождение других молекул АГЛ с какими-либо энергозависимыми помпами.

Синтез молекул АГЛ у V. fischeri осуществляется с помощью LuxI-синтазы. Анализ синтеза других молекул АГЛ у различных бактерий четко продемонстрировал, что для этого необходимо присутствие белков LuxI-типа. Субстратами для синтеза АГЛ являются молекулы S-аденозилметионина (SAM) и биосинтетические предшественники жирных кислот, синтезируемые при участии ацил-ацилпереносящего белка (ACP). Показано, что все гомологи LuxI-белка катализируют реакцию образования АГЛ. Фермент катализирует реакцию образования амидной связи между ацилированной боковой цепью и аминогруппой SAM. Поскольку образуется множество АГЛ с отличающимися структурами боковых цепей, то гомологи LuxI-белка должны распознавать различные коньюгаты ацил-ACP. Выяснено, что аминоконцевой домен молекулы является высоко консервативным и содержит 10 аминокислотных остатков, полностью гомологичных у различных белков LuxI-типа. Среди этих десяти консервативных аминокислот 7 является заряженными. Исходя из данных, что карбоксиконцевой домен является более вариабельным у различных представителей LuxI-белков, сделано предположение, что именно он обеспечивает распознавание различных ацилированных цепочек в молекулах ацил-ACP. Кроме того, анализ нескольких мутантных белков LuxI-типа позволил идентифицировать положение аминокислотных остатков, имеющих существенное значение для функциональной активности белка. Так, мутации, приводящие к полному отсутствию функциональной активности LuxI-белков, затрагивают область с 25 по 70 аминокислотный остаток; на основании чего можно сделать вывод о том, что эта область отвечает за ферментативную активность белка, а именно за формирование амидных связей. Анализ точечных мутантов показал, что по всей длине молекулы белка имеются консервативные остатки. С помощью сайт-направленного мутагенеза было продемонстрировано, что остатки цистеина в LuxI-белке не имеют значения для его функциональной активности, но важны для проявления функциональной активности у RhlI-белка Р. aeruginosa и TraI-белка Agrobacterium tumefaciens.

Помимо LuxI-синтазы у V. fischeri идентифицирован белок AinS (46 кДа), который не гомологичен LuxI, но имеет 34% гомологию с С-терминальным доменом LuxM-белка V. harveyi (25 кДа), который осуществляет позитивную регуляцию биолюминисценции у данного микроорганизма. Продуктом LuxM-синтазы является гидроксигексаноил-ГЛ. AinS-синтаза отвечает за продукцию октаноил-ГЛ. В настоящее время показано, что обе кворумные системы последовательно индуцируют биолюминесценцию и необходимы для успешной колонизации световых органов моллюсков (2). На ранних стадиях процесса колонизации LuxO-белок репрессирует экспрессию генов, ответственных за биолюминесценцию. LuxO ингибирует транскрипцию litR -гена, кодирующего активатор транскрипции lux -оперона и luxR-гена. При достижении плотности 10⁸ кл/мл синтезируемый с помощью AinS сигнал оказывает двойной эффект: во-первых, индуцирует биолюминесценцию в результате прямого связывания с LuxR и инактивирует LuxO, и, во-вторых, усиливает транскрипцию litR -гена. В свою очередь, LitR-белок позитивно влияет на транскрипцию luxR, что при увеличении плотности популяции усиливает биолюминесценцию, регулируемую кворумной сенсор ной системой LuxI-LuxR. [3].

Заключение.

С помощью эффекта кворума регулируется широкий спектр физиологических процессов у различных видов бактерий, что может иметь практическое применение. Микроорганизмы используют эффект кворума для регуляции свойств вирулентности, что может быть использовано на практике, если каким-то образом влиять на передачу сигнала. Раскрывая устройство таких процессов, можно решать серьёзные проблемы медицины, в частности, снижение эффективность применения антибактериальных препаратов. Поэтому изучение механизмов реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами, а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов [3,4].

Список литературы.

Журнал общей биологии. 2009. Т 70, вып. 3. С. 225-238.

https://humbio.ru/humbio/tarantul_sl/00000a4c.htm.

https://www.bio.bsu.by/proceedings/articles/2006-1-1-42-55.pdf

Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т 48, вып. 10. С. 32-39.

Tao Long, Kimberly C. Tu, Yufang Wang, Pankaj Mehta, N. P. Ong, Bonnie L. Bassler, Ned S. Wingreen. Quantifying the Integration of Quorum-Sensing Signals with Single-Cell Resolution // PLoS Biology. 2009. V. 7(3). P. e1000068. doi:10.1371/journal.pbio.1000068.

Приложение.

Приложение 1.

Приложение 2.

Этот график иллюстрирует работу «молекулярного переключателя», регулирующего поведение светящейся бактерии Vibrio harveyi в зависимости от концентрации двух сигнальных веществ (AI-1 и AI-2), которые используются бактериями для общения друг с другом. По горизонтальным осям — концентрации двух веществ, по вертикальной оси — величина, обратная силе реакции бактерии на данный химический сигнал. Видно, что «молекулярный переключатель» имеет три устойчивых состояния: «синее» (концентрации обоих веществ высокие, реакция максимальная), «зеленое» (концентрация одного из веществ, причем любого из двух, высокая, а другого — низкая, реакция промежуточная) и «красное» (концентрации обоих веществ низкие, реакция минимальная) [4].