Курсовая работа
Роль медицинского лабораторного техника в приготовлении питательных сред в современной микробиологической лаборатории
Хабаровск 2014
Содержание
Введение
1. Состав различных питательных сред
. Приготовление различных питательных сред
Источники элементов, используемые для приготовления питательных сред
Основные принципы изготовления питательных сред
. Качественное преимущество промышленных питательных сред
Значение промышленного производства сред
Производство / Технологии
Многостадийный контроль качества
Документы
Заключение
Список использованных источников
Введение
Целью курсовой работы является рассмотрение факторов влияющих на качество приготовления питательных сред. Исходя из указанной цели, можно выделить задачи, поставленные в курсовой работе:
. На основе анализа литературы выявить особенности состава различных питательных сред.
. Выявить особенности приготовления различных питательных сред.
. Доказать качественное преимущество промышленных питательных сред.
Питательные среды без преувеличения могут считаться одним из основных компонентов микробиологических исследований. Современная микробиология без питательных сред существовать не может, а их качество во многом определяет информативность, точность микробиологического анализа. Число включенных в ряд руководств питательных сред (с учетом модификаций) превысило 5000 прописей, причем эта цифра вряд ли может считаться полной.
С каждым годом проблема микробиологических питательных сред получила дальнейшее развитие. Внедрение противомикробных лекарственных препаратов, в первую очередь антибиотиков, потребовало широкой гаммы питательных сред для культивирования продуцентов, определения антибиотических веществ в ферментационных жидкостях, субстанциях, лекарственных формах и в биологических субстратах (при изучении фармакокинетики антибиотиков), а также для определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным лекарственным средствам. С особой остротой была поставлена задача стандартизации питательных сред, многие из которых содержат недостаточно стандартные или просто плохо стандартизуемые компоненты. В этой связи все больше заявляют о себе многокомпонентные синтетические питательные среды, одним их родоначальников которых можете быть назван Герберт (1961 г.). Их широкое применение пока сдерживают технологические и экономические вопросы, но перечень сред, содержащих частично или полностью стандартные компоненты, неуклонно увеличивается. Тем не менее, проблема микробиологических питательных сред, в том числе для клинической практики, остается актуальной, а сама сложившаяся ситуация имеет ряд негативных моментов. Качество серийных образцов в некоторых случаях оставляет желать лучшего, а внутрилабораторный контроль питательных сред, как система, пока не внедрен. Вызывает сожаление узкий круг номенклатуры используемых сред, о некоторых из них, эффективных, с высокой избирательностью ростовых свойств, неправомерно забывают. Безусловно, это чаще всего связано с экономическими причинами. Но, в ряде случаев, отрицательную роль играет информационный вакуум.
1. Состав различных питательных сред
Питательные среды для культивирования микроорганизмов должны содержать все элементы, необходимые для их роста, в определенных концентрациях, определенной химической форме и в том количественном соотношении, в каком они находятся в клетках.
Агар-агар - растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным содержанием азотистых веществ. Желатина - кислый азотсодержащий продукт, добываемый путем выварки костей и хрящей. В качестве плотных питательных сред широко применяют также гелевые пластины, введенные в микробиологическую практику С.Н. Виноградским. Для выращивания микроорганизмов, использующих органические формы азота, часто употребляют мясопептонные среды: мясопептонный бульон, мясопептонный агар и мясопептонную желатину. Мясопептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают так: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилии заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55°С.
Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй - через бумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они являются фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация излишня. Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, а затем мясо отжимают. Бульон получается хорошего качества. Если желательно иметь мясной бульон особо высокой питательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой.
Пепсин дополнительно гидролизует белковые соединения мяса, и количество усвояемых бактериями питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 л среды. Для приготовления мясопептонного бульона к 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (пептон - первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na2CO3 (до посинения влажной красной лакмусовой бумажки; при этом фенолфталеин еще не показывает щелочную реакцию - при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска не выявляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1-2 капли его вносят стеклянной палочкой в фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона.
В нейтральной среде бромтимолблау бутылочно-зеленый, в кислой - желтый, в щелочной - синий. После установления реакции среду снова кипятят 5-10 мин и белки, свернувшиеся от изменения реакции, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Прозрачный Мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л мясо-пептонного бульона добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара.
Среду нагревают до растворения агара (температура плавления его 100°С, застывания -40°С),устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2CO3 и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для разливок в чашки - агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливе агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 20 мин. Мясо-пептонная желатина (МПЖ). В 1 л мясопептонного бульона помешают 100-150 г желатины. Температура плавления зависит от процентного содержания в среде. 10%-ная желатина плавится при 24°С, 15%-пая - при 25°. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины. После растворения желатины при осторожном нагревании в среде устанавливают слабощелочную реакцию (как и для МПБ и МПА), кипятят в течение 5мин, затем охлаждают -до 40-50°С. Одновременно яичный белок взбивают с небольшим количеством воды, вливают его в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков становится прозрачной. Ее фильтруют через горячую воронку, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду по 30 мин через 24 ч 3 раза.
Картофельный агар. 200 г очищенного и промытого водой картофеля нарезают ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и доводят до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его растворения и устанавливают нейтральную реакцию среды (рп 7,0). Среду стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. Пивное сусло. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35°С. После того как ростки будут вдвое больше длины зерна, последнее высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании) и получают солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и 250 г его берут на 1 л воды. Смесь подогревают при 57°С (для лучшего выделения фермента амилазы) до исчезновения реакции на крахмал (синее окрашивание с йодом).
Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости. Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10- 20% сахара. Определив его содержание по плотности раствора с помощью сахариметра, сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8%, стерилизуют при 115°С (давление 0,5 атм) в течение 30 мин. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе. Сусло-агар. К приготовленному суслу добавляют 2,5-3% агара, кипятят до его расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют таким же способом, как пивное. Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред употребляют снятое молоко, так называемый обрат (жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов).
Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34°С. Жир можно удалять и при отстаивании молока. При стерилизации молока следует учитывать, что его нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться. Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115°С (давление 0,5 атм) 15 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают трое суток в термостате при 30°С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 дня каждую пробирку с молоком просматривают и пробирки, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают. При стерилизации в автоклаве иногда наблюдается побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизации казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретое побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.
Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50-100 г сухих дрожжей размешивают в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по полчаса в течение трех дней ежедневно. Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, добавляют 2 г Na2HPO4, 1 н. раствор NaOH (до рН 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37°С двое суток, доводят до рН 7,4, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115°С полчаса. Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115°С 30 мин.
2. Приготовление различных питательных сред