Центрифугирование.
Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещённую в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму и размеры, осаждаются с разной скоростью.
Дифференциальное центрифугирование.
Этот метод основан на различиях в скорости седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Различный материал, например, гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определённая фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно.
В начале все частицы гомогената распределены по объёму центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых сложных частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном тяжёлый частицы, но, кроме этого, также некоторое количество исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжёлые частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование надосадочной жидкости (супернатанта) при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к оседанию (седиментации) частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих меньшую плотность.
Рис.1. Дифференциальное центрифугирование суспензии частиц в центробежное поле.
Дифференциальное центрифугирование является самым распространённым методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется для разделения клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но и в этом случае получаемые фракции не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивающие более эффективное разделение.
Центрифугирование позволяет получить различные фракции субклеточных частиц и исследовать свойства и функции каждой фракции в отдельности. Например, из листьев шпината можно выделить хлоропласты, отмыть их с помощью повторного центрифугирования в соответствующей среде от клеточных фрагментов и исследовать их поведение в различных экспериментальных условиях или же определить их химический состав.
Далее можно, применяя различные модификации методики, разрушить эти пластиды и выделить посредством дифференциального центрифугирования (повторного осаждения частиц при различных величинах ускорения) составляющие их элементы. Таким путем удалось показать, что пластиды содержат структуры, отличающиеся очень упорядоченным строением, — так называемые граны.
Достоинства этого метода просто неоценимы, поскольку он позволяет выявить существование функциональных субъединиц, входящих в состав более крупных субклеточных частиц; в частности, используя метод дифференциального центрифугирования, удалось показать, что граны являются основным структурным элементом хлоропласта.
Применение метода дифференциального центрифугирования сопряжено со многими методическими трудностями. Во-первых, при выделении частиц можно повредить их структуру. Поэтому потребовалось разработать специальные методы разрушения клеток, которые бы не вызывали повреждения структуры субклеточных фракций. Во-вторых, поскольку субклеточные частицы обладают мембранами, в процессе их выделения могут возникать разнообразные осмотические эффекты. Следовательно, для того чтобы ультраструктура исследуемых объектов не была разрушена еще при их выделении, необходимо тщательно подбирать состав среды, в которой производится разрушение клеток и осаждение частиц. И наконец, отмывание субклеточных частиц может приводить к потере некоторых содержащихся в них веществ, которые под действием сил диффузии переходят в раствор. В связи с этим иногда бывает трудно понять, какие из малых молекул действительно являются элементами исследуемых структур, а какие просто были адсорбированы их поверхностью в процессе выделения. Такое положение затрудняет точное определение некоторых функциональных свойств выделенных объектов. С другой стороны, поскольку результаты исследований оставались неизменными при очень широком диапазоне условий выделения и хорошо совпадали с данными, полученными иными методами, мы можем сделать общий вывод о том, что большая часть метаболических функций в клетке тесно связана с определенными структурными элементами, которые мы называем субклеточными частицами.