Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
«САМАРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени академика С.П. КОРОЛЕВА»
ЛАЗЕРНАЯ МЕДИЦИНА
Методические указания к курсовому проекту
САМАРА 2017
УДК 621.373.8
Составители: Д.Н. Артемьев, И.А. Братченко
Разработка лазерного медицинского прибора для возбуждения и регистрации флуоресценции: Метод. Указания к курсовому проекту/ – Самар. нац. исследов. ун-т.; сост. Д.Н. Артемьев, И.А. Братченко; Самара, 2017. 30 с.
Методические указания к курсовому проекту подготовлены на кафедре лазерных и биотехнических систем Самарского университета и предназначены для студентов дневного отделения, обучающихся по специальности 12.04.04 «Биотехнические системы и технологии» по дисциплине «Лазерная медицина».
В методических указаниях рассмотрены основные требования к выполнению курсового проекта по разработке лазерного медицинского прибора для возбуждения и регистрации флуоресценции. Приведен порядок выполнения проекта и требования к оформлению.
Ил. 15. Библиогр. 4 назв.
Рецензент: Кренц А.А., к.ф.-м.н., доцент кафедры физики
ВВЕДЕНИЕ
Курсовой проект направлен на разработку системы регистрации флуоресцентного сигнала (флуориметра). Задание выполняется на открытом онлайн-ресурсе https://searchlight.semrock.com/. SearchLight позволяет вам легко выбирать элементы для вашей системы, визуализировать спектральные свойства и быстро вычислять критические параметры, такие как яркость сигнала, уровни автофлуоресценции и отношение сигнал / шум. Благодаря интуитивно понятному интерфейсу можно легко проверить совместимость фильтров с различными флуорофорами, увидеть эффекты изменения компонентов системы (источники света, детекторы, задачи) или создать индивидуальные схемы для уникального приложения.
|
|
SearchLight содержит обширную библиотеку из 809 флуорофоров, 182 источников света, 21 детектор и всю библиотеку из 885 фильтров Semrock и 166 оптимизированных наборов. Вы также можете загрузить свой собственный набор данных для любых компонент, которые в настоящее время не включены в качестве выбора.
Флуоресценция – метод спектрохимического анализа, при котором молекулы анализируемого вещества возбуждаются при облучении определенной длиной волны, и излучают излучение различных длин волн. Спектр излучения содержит информацию полезную как для качественного, так и для количественного анализа [1].
Благодаря высокой чувствительности к малым количествам биологического материала и хорошей воспроизводимости результатов, метод флуоресцентного анализа используется для решения широкого круга задач в области молекулярной и клеточной биологии, вирусологии, биофизики мембран [2].
Для проведения флуоресцентной диагностики необходим специальный прибор – флуориметр. Флуориметр содержит следующие основные элементы: источник света, систему фильтров, детектор и исследуемый образец. Источниками возбуждающего света во флуориметрах обычно служат ртутные лампы низкого давления либо УФ-светодиоды. Система светофильтров состоит из двух светофильтров: очищающего и отрезающего, а также дихроичного зеркала. Очищающий должен пропускать свет в области поглощения определяемого вещества и не должен пропускать свет в области, отвечающей флуоресценции вещества. Отрезающий должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен им полностью поглощаться.
|
|
ЗАДАНИЕ НА КУРСОВОЙ ПРОЕКТ
Метод флуоресцентной диагностики основан на способности тканей поглощать излучение, с последующим испусканием флуоресценции. Анализируя полученный спектр, можно либо предположить заболевание у человека, либо предсказать осложнения таких заболеваний как сахарный диабет, рак кожи и других.
Для проведения флуоресцентной диагностики необходим специальный прибор – флуориметр. При измерении флуоресценции с помощью флуориметров существенное значение имеет правильный выбор светофильтров, источника возбуждающего света и детектора [3, 4].
Индивидуальное задание на выполнение курсового проекта предусматривает разработку модели флуориметра, подбор характеристик основных компонент оптического канала флуориметра, источника возбуждающего излучения и детектора.
РАБОТА С ОТКРЫТЫМ ОНЛАЙН-РЕСУРСОМ SEARCHLIGHT ДЛЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ И РЕГИСТРАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Расположение элементов
SearchLight состоит из одного экрана с четырьмя основными разделами:
1) Ввод данных (вверху слева): выберите из обширной базы данных спектров для фильтров, наборов фильтров, флюорофоров, источников света и детекторов. Введите свои собственные спектры в «Мои данные».
Рисунок 1 – Ввод данных
2) «Графическое окно» (сверху по центру): просмотр неограниченного количества спектров, загруженных в раздел «Обозначение графика», наложенных на один удобный график. Окно Plotting позволяет быстро визуально оценить совместимость фильтров, флуорофоров, источников света и детекторов.
|
|
Рисунок 2 – Отображение спектров в графическом окне
3) Управление спектрами (вверху справа) позволяет отслеживать и изменять спектры, загружаемые в активную среду SearchLight. Выберите спектры для отображения, изменяйте характеристики графика, загружайте спектры (ASCII) и удаляйте спектры из активной среды SearchLight.
Рисунок 3 – Окно управления спектрами
4) Калькуляторы (внизу): оценивают абсолютные и относительные сигналы (т.е. яркость или пропускную способность системы) и соотношение сигнал / шум (контрастность) для неограниченного количества комбинаций фильтров, флуорофоров, источников света и детекторов.
Рисунок 4 – Окно «Калькулятор»
Ввод данных
Доступные спектры:
Фильтры: выберите все доступные фильтры каталога Semrock. Спектры фильтров основаны на теоретических расчетах фильтров Semrock. Для получения наиболее точных расчетных результатов используются спектры проектирования (а не измеренные), поскольку реальные измерительные ограничения и артефакты приводят к измеренным спектрам фильтра, которые не точно отражают истинную крутизну края и оптическую плотность флуоресцентного фильтра.
Наборы фильтров: выберите из всех доступных наборов фильтров каталога Semrock, включая однополосные (очищающие) и длиннополосные (отрезающие) фильтры и многополосные наборы.
Флюорофоры: выберите из обширного списка флуорофоров. Спектры получены в основном из Университета Аризоны (www.spectra.arizona.edu) и Invitrogen (www.invitrogen.com). Заголовки текстовых файлов Fluorophore содержат больше деталей об источнике.
Источники света: выберите из списка ламп, лазер, светодиод и другие твердотельные источники света. Спектры основаны на данных, опубликованных производителем, а также на измеренных данных.
Детекторы. Выберите из списка широко используемых детекторов. Спектры детекторов основаны на данных, опубликованных изготовителем.
Мои данные: Загрузите собственные спектры (фильтры, флуорофоры, источники света и детекторы) или смоделируйте полосовой фильтр или длинновполосный дихроичный спектр светоделителя. Для загрузки пользовательских данных требуется учетная запись. Файлы для загрузки должны быть текстовыми данными ASCII с двумя столбцами с разделителями табуляции. Первый столбец должен содержать значения длины волны (в нм), а второй столбец должен содержать значения спектра (от 0 до 1). Текстовые заголовки над данными столбца будут сохранены для справки. Комментарии должны предшествовать «%».
Выберите спектры и загрузите в среду SearchLight:
Щелкните строки заголовков, содержащие имена разных типов спектров, чтобы развернуть список этих спектров.
Нажмите один раз на имя спектра в списке, чтобы просмотреть (в светло-сером) версию этого спектра в окне графика.
Дважды щелкните имя спектра или щелкните стрелку справа от названия спектра, чтобы добавить спектр в окно построение графиков и их управлением.
Введите поле вверху, чтобы быстро сузить все списки до элементов, содержащих текст поиска. Разделы без совпадений отключены.
Скрыть или показать раздел ввода данных:
Раздел «Ввод данных» можно скрыть, чтобы увеличить окно построения графика. Нажмите на стрелку на правом краю раздела ввода данных, чтобы свернуть (скрыть) или развернуть (показать) раздел.
Алгоритм взаимодействия с пользователем
SearchLight использует сложные алгоритмы для обеспечения расширенного пользовательского интерфейса. Например, вы можете найти совместимые продукты для выбранного флуорофора, чтобы сузить список потенциально совместимых возбудителей, излучателей, дихроичных зеркал или наборов фильтров.
Эта функция помогает сузить список фильтров, однако для оптимального выбора фильтра в зависимости от потребностей приложения требуется анализ пользователем. Современные алгоритмы оптимизированы для широкополосных источников света, и продолжается совершенствование других источников освещения, такие как светодиоды и лазеры.
Поиск совместимых продуктов. Существует два способа активировать функцию «Найти совместимые продукты»:
1) Выберите [Найти совместимые продукты...] в меню выбора продукта:
Рисунок 5 – Поиск совместимых продуктов
2) Выберите [Найти совместимые продукты...] из элемента в легенде:
Рисунок 6 – Поиск совместимых продуктов в окне управления графиками
После активации выберите тип продукта для поиска (Exciter, Emitter, Dichroic или Filter Set):
Рисунок 7 – Выбор типа фильтра
Список совместимых продуктов появится на соответствующей панели выбора продукта:
Рисунок 8 – Список совместимых продуктов
Очистите результаты поиска совместимого продукта, выбрав [Сбросить результаты поиска] в меню выбора продукта:
Рисунок 9 – Сброс результатов поиска
Моделирование фильтров.
- Разверните контекстное меню, щелкнув значок [Подробнее...] в легенде.
- Выберите [Model this filter...]:
Рисунок 10 – Выбор моделирования фильтра
- Введите требуемые спецификации AOI и CHA и выберите требуемое состояние поляризации, затем нажмите «Создать». Моделируемый спектр появится на графике предварительного просмотра:
Рисунок 11 – График предварительного просмотра при моделировании фильтра
- Чтобы закрыть диалоговое окно и добавить модельный спектр к сеансу, нажмите «ОК». Чтобы закрыть диалоговое окно без добавления моделируемого спектра в сеанс, нажмите «Отмена».
- Ваш новый спектр появится непосредственно под исходным выбранным спектром в легенде с параметрами моделирования, добавленными к имени:
Рисунок 12 – Отображение нового спектра в окне управления спектрами
- Если у вас есть учетная запись Semrock.com, сохранение сеанса SearchLight приведет к сохранению моделируемого спектра в разделе «Мои данные».
- Совместное использование сеанса SearchLight предоставит моделированные спектры другим пользователям. Сохранение общего сеанса SearchLight также сохранит любые смоделированные спектры в разделе «Мои данные» других пользователей.
Графическое окно
Управление графическим окном:
- Нажмите один раз на название спектра в разделе «Ввод данных», чтобы просмотреть спектр в окне «Построение» (светло-серый).
- Дважды щелкните по названию спектра или щелкните стрелку справа от имени спектра, чтобы добавить спектр в окно «Построение» и «Обозначение графика».
- Нажмите на значок шестеренки [Изменить настройки графика] в нижнем правом углу окна графика для общего контроля и подсказок построения.
- Наведите указатель мыши на любую кривую для просмотра значений точек данных, связанных с осями x и y.
Изменение диапазонов обеих осей:
- Нажмите на значок шестеренки в правом нижнем углу окна графика.
- Щелкните в любом месте областей с меткой длины волны (x) или спектра (y).
- Масштабирование с помощью прокрутки: прокрутка вверх, чтобы увеличить или уменьшить масштаб, чтобы уменьшить масштаб.
- Масштабирование по клику и перетаскиванию: нажмите и перетащите поле в окне графика, чтобы увеличить масштаб.
- Восстановить диапазон по умолчанию: дважды щелкните в любом месте окна графика, чтобы вернуться к диапазонам осей по умолчанию.
Изменение только длины волны (x). Диапазон длин волн по умолчанию составляет 350 - 750 нм. Диапазон может быть увеличен до 200 - 1600 нм. Нажмите на самую короткую или длинную метку длины волны, чтобы изменить диапазон длин волн.
Изменение только оси спектра (y). Ось спектра можно рассматривать в линейном масштабе (пропускание, 0 - 100%), в нормализованном (0 - 1) или по логарифмической шкале (оптическая плотность, где OD = -log10 (нормализованное значение). По умолчанию - пропускание.
Нажмите переключатели слева от окна построения, чтобы переключаться между типами шкал осей. Нажмите на самую маленькую или самую большую метку оси спектра, чтобы изменить диапазон спектра.
Управление графиками
Управление графиками - это список всех спектров, которые были загружены в активную среду SearchLight из списков ввода данных. После загрузки все эти спектры теперь доступны для визуализации в окне Plotting (Построение) и добавлены в калькуляторы.
Добавление спектров в окно управления (отображения) спектров. Дважды щелкните на имя спектра или щелкните стрелку справа от имени спектра в одном из списков в разделе «Ввод данных», чтобы добавить спектр в окно «Построение» и «Управление спектрами».
Управление спектрами. Нажмите значок [Советы] в заголовке «Легенда», чтобы получить справку:
- Измените порядок элементов легенды, перетащив их.
- Показывать или скрывать спектр в окне «Построение», установив или сняв флажок в «Управление спектрами».
- Выделите один спектр (или группу спектров для набора фильтров или флуорофора) в окне графика, щелкнув его имя в легенде. Отметьте его, щелкнув в любом месте за пределами легенды.
- Выделите только компоненты из данного калькулятора, выбрав имя калькулятора в раскрывающемся списке в заголовке легенды или нажав кнопку «Ссылка на окно графика» в этом калькуляторе. Просмотрите все спектры в легенде, выбрав «Все» в раскрывающемся списке.
- Разверните контекстное меню, щелкнув значок [Подробнее...]. Отредактируйте внешний вид отдельного спектра (или группы спектров для набора фильтров или флуорофора), щелкнув пункт меню [Изменить...]. Для каждого спектра или группы спектров вы можете изменить метку кривой, цвет кривой, стиль кривой (стиль линии и толщину), непрозрачность кривой и заполняется ли кривая. Загрузите спектр в локальную компьютерную среду, щелкнув его пункт меню [Загрузить]. Удалите спектр из Легенды, щелкнув пункт меню [Удалить]. Добавьте стандартный размер фильтра или отмонтированного фильтра в корзину покупок semrock.com, щелкнув пункт меню [Добавить в корзину]. Просмотрите фильтр или установите на semrock.com, щелкнув его пункт меню [View on Semrock.com]. Детали продукта откроются на новой вкладке.
- Чтобы сразу манипулировать всеми элементами в легенде, щелкните значок [Подробнее...] в заголовке легенды. Загрузите zip-файл, содержащий все спектры, щелкнув пункт меню [Загрузить все]. Удалите все спектры, щелкнув пункт меню [Удалить все]. Удалите выбранные спектры, щелкнув пункт меню [Удалить выбранный]. Добавьте стандартный размер всех фильтров или отмонтированных наборов фильтров в корзину покупок semrock.com, щелкнув пункт меню «Добавить все продукты Semrock в корзину».
Калькулятор
Калькулятор SearchLight количественно вычисляет отношение флуоресценции к шуму и отношения сигнал / шум для неограниченных комбинаций наборов фильтров, флуорофоров, источников света и детекторов. Расчеты основаны на простой математической структуре, которая подробно описана в книге «Спектральное моделирование в флуоресцентной микроскопии» (https://www.semrock.com/Data/Sites/1/semrockpdfs/spectral_modeling_in_fluorescence_microscopy.pdf). Помимо основных спектров, дополнительные входные параметры системы включают в себя другие спектрально-зависимые потери в системе, эффективность сбора оптики и характеристику флуорофоров с помощью квантовых выходов и десятичных коэффициентов молярной экстинкции.
Особенность калькулятора SearchLight заключается в том, что он позволяет количественно оценивать совместимость наборов фильтров с флуорофорами и другими спектрально-зависимыми компонентами системы, анализ перекрестных помех и просачивания, определение оптимальных участков спектральных краев для набора фильтров в конкретных условиях эксперимента, и руководство по протоколам маркировки в мультиплексировании анализов изображений. Эти анализы могут быть одновременно проведены в нескольких конфигурациях системы, создавая несколько калькуляторов, тем самым позволяя проводить многомерные анализы проектирования эксперимента.
Калькулятор предполагает следующую типичную конфигурацию флуоресцентного микроскопа со спектральными характеристиками, подробно описанными ниже. Вычисления также применимы к неизображающим системам, а также к конфигурациям без примеси. Например, нет необходимости включать дихроичный светоделитель (при отсутствии его спектры пропускания и отражения считаются единичными для всех длин волн).
Рисунок 12 – Схематическая диаграмма типичной конфигурации флуоресцентного микроскопа на основе оптических фильтров (слева) и примеры спектров поглощения и излучения для флуорофора, спектры пропускания для набора оптических фильтров и спектры источников света и детектора (справа). Источник света (черный) - это ксеноновая дуговая лампа с профилем отклика (коричневый), представляющим типичную (охлажденную) ПЗС-камеру.
Входные данные калькулятора.
- Имя экземпляра калькулятора. Имя можно изменить.
- Набор фильтров: название набора из 3 фильтров. Хотя фактический набор фильтров может состоять из множества возбудителей и излучателей, для Калькулятора предполагается, что набор состоит из одного возбудителя, одного излучателя и дихроичного светоделителя. Выбор набора фильтров, загружаемого в графическое окно, автоматически заполняет возбудитель, эмиттер и дихроичный делитель, которые связаны с этим фильтром, указанным в раскрывающихся списках ниже. Для многополосных наборов по умолчанию выбираются первый возбудитель и первый эмиттер в списке, но их можно изменить.
- Возбудитель - название фильтра возбуждения. Это поле заполняется по умолчанию при выборе фильтра. Также можно назначить любой отдельный фильтр в качестве возбудителя, даже если он не является частью набора фильтров. Спектр возбудителя представлен как TX(λ) на диаграмме выше.
- Излучатель - название отрезающего фильтра. Это поле заполняется по умолчанию при выборе фильтра. Также можно назначить любой отдельный фильтр в качестве излучателя, даже если он не является частью набора фильтров. Спектр эмиссионного фильтра представлен как TM(λ) на диаграмме выше.
Дихроик - название дихроичного светоделителя. Это поле заполняется по умолчанию при выборе фильтра. Также возможно обозначить любой отдельный фильтр как дихроичный, даже если он не является частью набора фильтров. Дихроичный спектр представлен как TD(λ) и RD(λ) на диаграмме выше, соответствующей спектрам пропускания и отражения фильтра соответственно. Для характеристики дихроичности необходимы только данные передачи, так как предполагается, что RD(λ) = 1 - TD(λ).
Флуорофор - название флуорофора. Спектр флуорофора состоит из двух различных спектров: спектра поглощения и спектра эмиссии. Эти спектры загружаются по умолчанию в поля абсорбции флюорофора и флуорофора при выборе имени флюорофора. Чтобы загрузить пользовательский флуорофор в список «Мои данные» в разделе «Ввод данных», необходимо загрузить (нормализованные) спектры поглощения флуорофора и флуорофора в виде двух отдельных файлов данных. Чтобы обеспечить квантовое значение флуорофора, добавьте следующий заголовок в файл эмиссии «квантовый выход»: число между 0 и 1.
- Поглощение флюорофора - спектр поглощения флуорофора. Это поле заполняется по умолчанию при выборе флуорофора. Спектр поглощения представлен как φA(λ) на диаграмме выше. Он нормализуется таким образом, что значение на максимальной длине волны поглощения равно 1.
- Эмиссия флуорофора: спектр излучения флуорофора. Это поле заполняется по умолчанию при выборе флуорофора. Спектр излучения представлен как φE(λ) на диаграмме выше. Он нормализуется таким образом, что значение на максимальной длине волны излучения равно 1.
- Источник света - спектр выбранного источника света. Только для отображения SearchLight автоматически нормализует отображаемый спектр таким образом, что пиковое значение равно 1. Однако для вычислений SearchLight нормализует область под кривой, так что общая мощность, интегрированная по всем длинам волн, равна значению, введенному в продвинутые настройки Калькулятора. Спектр источника света представлен как L(λ) на диаграмме выше.
- Детектор - профиль спектрального отклика детектора. Спектр детектора представлен как D(λ) на диаграмме выше. Для камер ПЗС и КМОП пиковое значение спектра отклика детектора считается пиковым квантовым эффектом камеры, тогда как для всех других типов детекторов спектр нормализуется таким образом, что пиковое значение равно 1. Это соглашение о нормализации должно быть при загрузке пользовательского спектра детекторов в список «Мои данные» в разделе «Ввод данных».
Расширенные настройки входных данных калькулятора
- Мощность источника света (мВт): полная мощность источника возбуждающего света, встроенная во все длины волн. Он представлен как PL на диаграмме выше.
- Числовая апертура: числовая апертура (NA) объектива, которая собирает флуоресцентное излучение от образца. Предполагается, что система собирает флуоресценцию из образца на телесный угол (в стерадианцах)
где n - показатель преломления (см. ниже). Таким образом, доля полной флуоресценции, испускаемой из образца, захваченной объективом, равна Ω / 4π.
- Показатель преломления среды между линзой объектива и образцом. См. Цифровую диафрагму выше, чтобы понять влияние индекса.
- Отраженный фактор свечения возбуждения: введен эмпирический множитель, учитывающий количество света возбуждения, которое перенаправляется с пути возбуждения на траекторию излучения (в основном за счет отражения образца и его поддерживающего стекла). Значение по умолчанию 0,07 предполагает, что 7% света возбуждения перенаправляется от пути возбуждения в путь излучения. Это значение считается не зависящим от длины волны. Он представлен коэффициентом ƒER.
- Пропускающий коэффициент свечения возбуждения: эмпирический фактор, введенный для учета передачи спектра всей другой оптики на пути возбуждения света. Значение по умолчанию 0,95 предполагает, что оптика на пути возбуждения (за исключением возбудителя и дихроичного светоделителя) имеет 95%-ную передачу. Это значение считается не зависящим от длины волны. Он представлен множителем Ti(λ) на диаграмме выше.
- Оптическая глубина флуорофора (M см): продукт молярной концентрации флуорофора («c», M = моль / литр = 10-3 моль/см3) и толщины слоя флуорофора («d», см). То есть оптическая глубина = c × d. Этот термин может быть использован для оптимизации соотношения концентраций флуорофорной маркировки, чтобы минимизировать кровотечение, например.
- Fluorophore DMAC (M-1 см-1): максимальное значение десятичного молярного коэффициента экстинкции для флуорофора. Эта величина является свойством флуорофора, и ее значение обычно доступно у производителя флуорофора. Калькулятор SearchLight автоматически заполняет это значение для выбранного флуорофора, когда он доступен в соответствующем файле данных. Если это значение недоступно, предполагается, что оно составляет 80 000, а поле DMAC выделяется желтым цветом. Чтобы правильно рассчитать перекрестные помехи между флуорофорами, необходимо использовать правильное значение DMAC. Флуорофорный DMAC представлен как ε10, пик на диаграмме выше. Обратите внимание, что Fluorophore DMAC × Fluorophore Quantum Yield является мерой яркости флуорофора.
- Квантовый выход флуорофора для целевого флуорофора. Эта величина является свойством флуорофора, и ее значение обычно доступно у производителя флуорофора. Калькулятор SearchLight автоматически заполняет это значение для выбранного флуорофора, когда он доступен в соответствующем файле данных. Если это значение недоступно, предполагается, что оно равно 0,5, а поле Quantum Yield выделено желтым цветом. Чтобы правильно рассчитать перекрестные помехи между флуорофорами, необходимо использовать правильное значение квантового выхода. Квантовый выход представлен как ηF на диаграмме выше. Обратите внимание, что Fluorophore DMAC x Fluorophore Quantum Yield является мерой яркости флуорофора.
- Фактор свечения аутофлуоресценции: эмпирический фактор, введенный для учета относительной силы сигнала аутофлуоресценции к желаемому сигналу флуоресценции. Его рекомендуемое значение должно быть в диапазоне от 0 до 1. Значение по умолчанию 0.1 предполагает, что уровень сигнала автофлуоресценции составляет 10% от желаемого сигнала. Это значение считается не зависящим от длины волны. Примеры источников аутофлуоресценции в системах визуализации включают образец и его поддерживающее стекло, первичный объектив и другие линзы, оптические фильтры и любые другие оптические элементы. Фактор аутофлуоресценции представлен в виде fAF.
- Передаваемый коэффициент эмиссии - эмпирический фактор, введенный для учета спектра пропускания всей другой оптики в световом пути излучения. Значение по умолчанию 0,95 предполагает, что оптика на пути излучения излучения (за исключением дихроичного и излучателя) имеет 95%-ную передачу. Это значение считается не зависящим от длины волны. Он представлен коэффициентом To(λ) на диаграмме выше.
Выходные данные калькулятора.
- Сигнал флуоресценции (мВт) - общий желаемый сигнал флуоресценции, который достигает детектора (как раз перед тем, как фотоны превращаются в электроны). Обратите внимание, что светлый вход в калькулятор выражается в мВт, и поэтому выходной сигнал также выражается в мВт. Сигнал представлен как S.
- Шум возбуждающего света (мВт) - нежелательная мощность шума, которая достигает детектора и которая возникает в результате передачи и отражения источника возбуждения, пропускается через систему, включая отражение от образца, количественно определяемое отражаемым коэффициентом свечения возбуждения. Эта величина очень чувствительна к перекрытию и кромкам крутящих моментов фильтров возбуждения и излучения, а также к уровню и степени внеполосной блокировки в этих фильтрах. Он представлен как NE.
- Аутофлуоресцентный шум (мВт) - общая мощность шума, которая достигает детектора и которая возникает в результате нежелательной автофлуоресценции. Он представлен как NAF в.
- Соотношение сигнал / шум: отношение оптического сигнала к шуму (SNR), эквивалентное сигналу флуоресценции, деленное на сумму значений шума возбуждения и уровня автофлуоресценции. Обратите внимание, что вычисленное SNR учитывает только оптический сигнал и источники оптического шума. Расчет не учитывает электрический шум, который возникает, когда фотоны преобразуются в электроны в реальном детекторе (дробовой шум, темные отсчеты и т. д.). Чтобы вычислить только отношение сигнал-автофлуоресценция-шум, просто установите коэффициент отраженного возбуждающего света равным 0. Чтобы вычислить только отношение сигнал-шум-свет-шум, установите коэффициент освещения аутофлуоресценции равным 0.
Управление калькулятором
- Ссылка на окно построения (рядом с именем калькулятора) - эта кнопка отмечена в данном калькуляторе, только входы этого калькулятора проверяются в легенде построения и отображаются в окне графика. Кнопка может быть проверена только в одном калькуляторе за раз. Проверка этой кнопки эквивалентна выбору имени калькулятора из раскрывающегося списка в заголовке «управления графиками».
- Нормализовать другие калькуляторы относительно этих значений - эта функция чрезвычайно полезна. Для большинства практических случаев недостаточно знаний системы для получения точных абсолютных значений сигнала и шума, однако относительные сравнения между различными комбинациями спектров фильтра и флуорофора могут быть очень точными. Проверяя эту кнопку в конкретном калькуляторе, значения для сигнала, шума возбуждения и т. д. Во всех других Калькуляторах будут нормализованы к их соответствующим значениям в калькуляторе с отмеченной кнопкой.
Калькулятор оптимизации
«Калькулятор оптимизации» включает выходные данные калькулятора в зависимости от изменения спектральных границ фильтров. Например, спектральный край фильтра может быть изменен в диапазоне, заданном Input Array, для вычисления массива сигналов флуоресценции, шума и отношения сигнал-шум. Любая комбинация спектров возбудителя, излучателя и дихроичного делителя может быть одновременно выбрана для таких симуляций.
Ниже приведен пример использования этой функции. Скажем, нужно рассчитать изменение сигнала флуоресценции, когда край короткого волнового пропуска (SWP) излучателя FITC-3540C изменяется в диапазоне от -10 до +20 нм относительно номинального дизайна. То есть вычислить массив значений сигнала флуоресценции, когда выделенный край (толстая синяя линия) на следующем графике смещается в диапазоне от -10 до +20 нм (обозначается красными стрелками) от номинального дизайна. Обратите внимание, что номинальная конструкция фильтра относится к выбору фильтра в соответствующем калькуляторе.
Рисунок 13 – Оптимизация фильтров.
Чтобы настроить параметры для моделирования, перейдите на вкладку «Калькулятор оптимизации», которая принимает те же системные параметры, что и в соответствующем «Калькуляторе». Затем выполните следующие действия:
- Выберите отрезающий (эмиссионный) фильтр в качестве фильтра для моделирования.
- Укажите диапазон спектров фильтров (в нанометрах), по которым необходимо отрегулировать существующий спектральный край фильтра.
- Укажите диапазон изменения (-сдвиги в нм по отношению к номинальному дизайну).
- Укажите размер шага для расчета.
- Нажмите кнопку «Вычислить», чтобы получить результаты моделирования.
Рисунок 14 – Задание параметров для оптимизации фильтров.
Как только вышеуказанная информация будет заполнена в калькуляторе оптимизации, отображение спектрального графика изменится, как показано ниже. На этом рисунке выбранная спектральная функция выделяется синим цветом (более толстая линия), а диапазон моделирования обозначается узорными диагональными линиями.
Рисунок 15 – Визуализация оптимизации фильтров.
В рамках курсового проекта необходимо выполнить все возможные действия, представленные выше. По окончании моделирования провести анализ разработанной модели флуориметра.