При подозрении на листериоз бактериологическая диагностика включает микроскопическое исследование исходного материала, посевы на питательные среды, идентификацию выделенных культур по культурно-биохимическим и серологическим свойствам, а также постановку биологической пробы на лабораторных животных.
Морфологические и культуральные свойства. Микроскопическому исследованию подвергают тонкие мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. При приготовлении мазков-отпечатков - чистым предметным стеклом 3—4 раза прикасаются к поверхности среза органа. Мазки готовят непосредственно из материала, а также после выдержки (подращивания) проб в термостате в течение 4—6 часов. Мазки окрашивают по Граму, а также методами флуоресцирующих антител.
Возбудитель листериоза — полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5—2,0 мкм; она хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками, грамположительна (однако в старых культурах могут встречаться единичные грамотрицательные палочки).
Люминесцентно-серологическое исследование проводят с использованием прямого и непрямого методов флуоресцирующих антител в соответствии с Наставлением по лабораторной диагностике листериоза животных (от 1971 г. с изменением от 31 июля 1974 г)*. С помощью двух методов можно идентифицировать возбудителя в культурах, обнаружить листерии в органах и тканях, а также определить их серогрупповую принадлежность.
Для выделения культуры листерий из органов и обязательно из головного мозга проводят обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию из головного мозга и паренхиматозных органов на физиологическом растворе в соотношении 1: 5 и из нее делают посевы. Для культивирования листерий используют обычный или печеночный агар и бульон с добавлением 1% глюкозы и 2—3% глицерина (pH среды 7,2—7,4), а также кровяной агар и специальные среды.
При хранении патологического материала в холодильнике при +4 °С происходит размножение и накопление листерий. Поэтому в качестве дополнительного метода рекомендуется часть исследуемого материала помещать в холодильник и сохранять в течение 30 дней для проведения повторных исследований через каждые 10 дней при отрицательном результате первичного посева. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С с ежедневным просмотром в первые 3—4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение 2 недель.
Характерным для возбудителя листериоза является легкое помутнение бульона и появление мелких росинчатых колоний на агаре, наличие бетта-гемолиза на кровяном агаре. Колонии листерий имеют в отличие от колоний других микроорганизмов голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру. Выделенные культуры изучают микроскопически с окраской мазков по Граму, а также с применением прямого и непрямого методов флуоресцирующих антител.
При получении смешанной культуры ее очищают общепринятыми методами, а также путем заражения молодых белых мышей массой до 16 г. Определение подвижности проводят методом висячей или раздавленной капли. На подвижность исследуют 6 — 12-часовую бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре. Листерии, выращенные при данной температуре, обладают активной подвижностью.
Для определения ферментативных свойств чистую культуру пересевают на пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, рамноза, салицин, трегалоза, дульцит, инулин, раффиноза). Листерии разлагают с образованием кислоты (без газа) глюкозу, мальтозу, рамнозу, салицин, трегалозу и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу.
Ставят пробу на каталазу. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленного 5%-ного пероксида водорода, при исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель пероксида водорода. При наличии фермента каталазы пероксид водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пены). Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий.
Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней можно использовать индикаторные среды, метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерий.
Исследуемую бульонную культуру или смыв агаровой культуры засевают в объеме 2—4 капель не менее чем на 2 индикаторные среды: например, с нейтральным красным в смеси с метиленовой синью, метиловым красным. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37—38 °С вместе с контрольными (незасеянными) средами. Результат учитывают через 3; 6; 24 и 48 ч.
Возбудитель листериоза через 3—6 ч обесцвечивает среду с нейтральным красным в смеси с метиленовой синью до цвета бульона, лишь у поверхности на границе с воздухом остается окрашенный ободок. При встряхивании цвет частично восстанавливается, поэтому посевы просматривают, не встряхивая пробирки. Среда с метиловым красным обесцвечивается через 3—6 ч, но восстановления цвета среды не происходит, Контролем служат незасеянные индикаторные среды. Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред.
Серотипизация. Серологическая идентификация листерий проводится с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой, представляющей собой смесь кроличьих листериозных агглютинирующих сывороток и содержащей факторы (антитела) Н-АВ и О-II, V, VII, IX. Поливалентная сыворотка в капельной реакции агглютинации на стекле агглютинирует все известные серотипы и подтипы листерий. Типовые сыворотки агглютинируют культуры листерий соответствующих типов ("серогрупп"). Сыворотка 1-го серотипа (серогруппы) содержит 0-фактор II, а сыворотка 2-го серотипа (серогруппы) — О-факторы V, VI. Серологическая типизация листерий осуществляется в соответствии с Наставлением по лабораторной диагностике листериоза.
Постановка биологической пробы. Для определения вирулентных свойств ставят биопробу. Биологическое исследование проводят на 2—3 белых мышах массой 18 г. Суспензию из головного мозга и внутренние органов или культур вводят животным под кожу или внутрибрюшинно в дозе 0,3—0,5 см3. Для повышения эффективности биопробы мышам за 3 —4 ч до заражения инъецируют внутримышечно кортизон в дозе 5 мг. При положительной биопробе животные погибают через 2—6 сут после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. В отдельных случаях этих поражений может не быть.
Очень чувствительны к подкожному заражению 5 - 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18—36 ч. К заражению листериями восприимчивы и кролики при внутривенном заражении культурой листерий в дозе 0,5 — 1 млрд. микробных тел.
Из внутренних органов павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды. Срок наблюдения за подопытными животными - 14 сут.
Дифференциация листерий от возбудителя рожи.
При бактериологическом исследовании мяса на листериоз и рожу свиней (срок исследования — 7 лет) проводят дифференциацию выделенных культур по морфологическим, биохимическим признакам и вирулентности
При необходимости дополнительной дифференциации бактерий листериоза от бактерий рожи свиней применяют посевы: на питательный желатин, на углеводную среду с салицином, на мясо-пептонный печеночный агар с 0,01 % теллурита калия, на мясо-пептонный агар с кровью, а также ставят конъюнктивальную пробу на морских свинках.
Бактерии листериоза в отличие от бактерий рожи свиней на желатине дают медленный рост в виде узловатой нити с неровными краями и пушистыми отростками, желатин не разжижают, ферментируют салицин, вызывают гемолиз на агаре с кровью, растут на мясо-пептонном печеночном агаре с 0,5 % глюкозы, 3 % глицерина и 0*01 % теллурита калия в виде мелких черных колоний и вызывают кератоконъюнктивит у морских свинок.