Место и период прохождения практики

Прохождение практики осуществлялось на кампусе ДВФУ в ШБМ с 26.06.2017 г. по 15.07.2017 г.

Цели практики: ознакомившись с основными правилами техники безопасности при проведении лабораторных исследований, изучить устройство и эксплуатацию общелабораторного оборудования. Научиться готовить растворы заданной концентрации, доводить растворы до заданного pH, ознакомиться с методами расчета концентраций. Освоить основные принципы приготовления гистологических препаратов и их анализа. Научиться выделять белки из биологических образцов и визуализировать их, попутно определяя молекулярную массу, с помощью электрофореза.

Задачи практики:

· Ознакомление с принципами устройства и эксплуатации общелабораторного оборудования и технологией мытья и стерилизации лабораторной посуды.

· Приготовить растворы с доведением до нужного pH.

· Взятие биологического материала для проведения гистологических работ.

· Приготовление гистологических препаратов из тканей крысы.

· Разморозить клеточные культуры (глиома С6), оценить их жизнеспособность. Оценить влияние эмбриональной бычьей сыворотки на рост клеточных линий. Провести МТТ-тест

· Провести электрофорез белков, предварительно приготовив растворы (NH₄)₂SO₄, PBS-буфер

· Проанализировать полученные препараты.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Краткая характеристика деятельности предприятия, учреждения

Организационная структура предприятия, учреждения

Лаборатория «Биомедицинских клеточных технологий», находящаяся в ШБМ, ДВФУ.

Организация рабочего места

Результаты выполнения программы практики:

Вводная часть

Во-первых, мы ознакомились с техникой безопасности, правилами работы с оборудованием в лаборатории, схемой мытья лабораторной посуды. Последняя представляет из себя последовательность этапов:

1. Мытье с порошком;

2. Цикл химика (10 в проточной воде, 3 раза в дистиллированной);

3. Замачивание в 10% р-ре «Белизны» (гипохлорит натрия) (от 2-х ч. до 3 сут.);

4. Цикл химика;

5. Замачивание в 1% р-ре 7X (от 2-х ч. до 7 сут.);

6. Цикл химика;

7. Замачивание в дистиллированной воде на срок от 15 мин. до 2-х часов;

8. Сушка на столе;

9. Сушка в сухожаровом шкафу

Во-вторых, мы выполняли задания по приготовлению растворов с заданной концентрацией с доведением до нужного pH и без него. Выполняя индивидуальное задание, я приготовил 1000 мл 192 мМ раствора трис-глицинового буфера, доведя его pH до значения 8,4

Белки

Первым этапом был выбор источника биоматериала. Им оказалась печень лабораторной крысы чистой линии. Вторым этапом было взятие биоматериала, его пестичная гомогенизация (грубый экстракт) с добавлением PBS и PMSF (ингибитор сериновых протеаз). Вторым этапом было осветление - мы центрифугировали смесь, отделили супернатант, тем самым проведя экстракцию белков. Третий этап, высаливание, мы проводили в несколько этапов:

1. Добавление сульфата аммония 30% насыщения, центрифугирование. Сушка осадка на фильтровальной бумаге;

2. Добавление в надосадочную жидкость сульфата аммония 50% насыщения, центрифугирование. Сушка осадка на фильтровальной бумаге;

3. Добавление в надосадочную жидкость сульфата аммония 70% насыщения, центрифугирование, сушка осадка, надосадочную жидкость вылили.

Необходимый объем сульфата аммония мы каждый раз рассчитывали по формуле: , где Х1- исходная степень насыщения, а Х2-конечная. Четвертым этапом был диализ: мы разбавили 3 получившихся осадка фосфатным буфером, сделали диализные мешки, поместили их в PBS и оставили на ночь. Далее провели электрофорез. Непосредственно для электрофореза приготовили два геля, концентрирующий и разделяющий. Собрали установку для электрофореза, а затем залили сначала разделяющий гель, затем концентрирующий. В образовавшиеся кармашки залили образцы, а по бокам стандарты. По окончании электрофореза отделили концентрирующий гель с белками от стекол и поместили в краситель Кумасси. После окраски на специальном приборе получаем следующее изображение

Разделение полос прошло успешно. Зная стандарты, можно теперь узнать молекулярные массы (в дальтонах) исходных белков печени крысы.

4. Культура клеток. Прежде всего, мы ознакомились с основными принципами организации лаборатории для культивирования и прослушали теоретическую часть. После этого нам выдали культуру глиомы С6 мозга человека в культуральном фласке Т75.Приготовив рабочий раствор трипсина 0,25% концентрации, добавил его во фласк. Инкубировали 10 минут при температуре 37 градусов по Цельсию при содержании углекислого газа 5%. Слив суспензию свободных клеток (около 5 мл) в Falcon, добавили к клеткам краситель трипановый синий, что позволил нам определить концентрацию живых клеток в камере Горяева. Чтобы избавиться от среды, содержащей остатки трипсина, осадили клетки центрифугированием. Поместили клетки в среду DMEM, содержащую компоненты: 10% FBS с ростовыми факторами, 1% пеницилина-стрептомицина, антимикотические препараты (получили стандартную среду культивирования). Далее приготовили 96-ти луночный планшет (6400 клеток/лунка, или 20000 клеток на см^2. Здесь был проведен МТТ-тест, использовавшийся в качестве контроля. В соседнем планшете приготовили 4 «стобца» лунок по два повтора, имея в каждом «столбцов» следующий состав:FBS + DMEM; 5% Паниксин + DMEM; 10% Паниксин + DMEM; 5% Паниксин + DMEM. Паниксин – это новый коммерческий препарат с неизвестным составом, являющийся искусственным заменителем эмбриональной бычьей сыворотки. Также в лунки добавили по 20 мкл раствора желтой соли реактива МТТ (MTT Solution (5 мг сухого вещества растворили в 1 мл PBS; приготовили раствор нужной концентрации)). Инкубировали планшеты 4 часа. Чтобы разрушить клетки и высвободить формазан (нерастворимый продукт МТТ реактива, получающийся в результате окисления МТТ реактива НАДФ-Н-зависимыми клеточными оксидоредуктазами), приготовили раствор МТТ Solvent (на изопропиловом спирте): 4 мМ НСl + 0,1 NP-40 + изопропанол. До начала инкубирования измерили светопоглощение формазана при начале культивирования, или то же самое, что светопоглощение 6400 клеток. В конце концов, проведя спектрофотометрию двух планшетов и использовав (какой-то) статистический метод оценки достоверности влияния эмбриональной бычьей сыворотки на рот клеточных линий, убедились в том, что раствор 10% Паниксина + DMEM оказал самое большое влияние на рост клеточной линии глиомы С6.