Определение структуры.
Первым шаг - производство высокочистой макромолекулы в большом количестве. После того, как последовательность изучаемой макромолекулы была идентифицирована и охарактеризована биоинформационными анализами, последовательность, соответствующая гену макромолекулы, клонируется в векторе экспрессии и продуцируется классически в бактериальном организме (обычно Escherichia coli). Затем макромолекулу экстрагируют из бактериальных клеток и очищают с использованием хроматографических методов.
Далее – получение концентрированного (порядка десятков граммов на литр) и высокочистого образца (более 98%) макромолекулы. Для этого ф-х методами макромолекулы переводят из растворимого в твердое кристаллическое упорядоченное состояние [8] путем изменения параметров: температура, рН, концентрации биологических макромолекул, а также природа и концентрация кристаллизующихся агентов и различных добавок [9].
Размер (от десятков до сотен микрон) и морфология полученных кристаллов сильно варьируются.
Дифракционные данные
Далее, кристаллы помещают в монохроматический луч рентгеновского излучения, (создаваемый генератором вращающегося анода или синхротронном излучении). Волны, рассеянные электронами макромолекул, трехмерно упорядоченных в кристалле, складываются в заданных направлениях и генерируют дифракционное пятно на экране. Все пятна, регулярно расположенные на некотором расстоянии, образуют дифракционную картину. Эта дифракционная картина восстанавливается с использованием нескольких сотен изображений, каждая из которых соответствует ориентации кристалла, который вращается во время измерения дифракционных данных. Информация, содержащаяся в каждом дифракционном пятне, характеризуется амплитудой и фазой структурного фактора.
Трехмерное распределение пятен связано с параметрами ячейки, составляющие элемент объема (ячейку), который регулярно повторяется в пространстве и позволяет описывать кристалл. Распределение интенсивностей пятен связано с распределением электронной плотности (макромолекулы) в клетке. Математически это означает, что дифракционная картина представляет собой фурье-преобразование электронной плотности.
От данных дифракции к плотности электронов
Для оценки фаз существуют три основных метода [12].
Первый метод - замена молекул. Используется известная структура гомологичного белка. Он состоит из построения виртуального кристалла путем размещения гомологичной структуры в ячейке кристалла, изучаемой с использованием математических функций перевода и вращения, и сравнения дифракционной картины, вычисленной из этого виртуального кристалла, и измеренных данных дифракции.
Второй метод - множественное изоморфное замещение, которое заключается в диффузии тяжелых атомов (богатых электронами) в кристалле. Наличие тяжелого элемента слегка изменяет интенсивности дифракции и, т.обр, сравнение дифракционной картины в присутствии и отсутствии этих тяжелых элементов позволяет оценивать фазы путем разбиения объекта на элементарные структуры после размещения в кристаллической решетке тяжелых атомов.
Третий метод - аномальная дисперсия. Этот метод состоит в изменении длины волны падающего луча вокруг края поглощения одного из атомов, содержащегося в молекуле. Сравнение дифракционной картины на разных длинах волн позволит оценить фазы с использованием методов, аналогичных методам изоморфного замещения [22].
От плотности электронов к структурной модели
Как только оценивается первый набор фаз, вычисляется первая карта плотности электронов. Если эта карта достаточно интерпретируема, макромолекула может быть построена шаг за шагом на этой карте (рис. 8). Используется комбинация автоматизированного алгоритма и ручного метода, доступного через программные средства интерактивной графики [25], что приводит к окончательной модели, состоящей из трехмерных координат каждого атома содержимого ячейки, состоящего из одной или нескольких макромолекул.
Из этой первой построенной модели интенсивности дифракции вычисляются по преобразованию Фурье и сравниваются с экспериментально измеренными интенсивностями. Что позволяет поэтапно улучшить модель.
Шаги после определения структуры
Последний шаг, после определения структуры с помощью рентгеновской дифракции - интерпретации структуры и ее осмысление в биологическом контексте [27-29]. Т.е., понимание структурной характеристики как трехмерного объекта и оценка его функции на клеточном или эволюционном уровне (биоинформатика).
Окончательный тип исследования направлен на то, чтобы превратить трехмерный объект в контекст знаний об основных биологических механизмах жизни, таких как знание о генной экспрессии с транскриптомикой, о сложности образования и взаимодействия и т.д. Можно оценить ф-х (в т.ч. электростатические) свойства, оценить структурные особенности в контексте систематики и эволюции и т.д. Эта информация будет включать в себя характеристику взаимодействующих с изученной макромолекулой др макромолекул в масштабе клетки или всего организма.
Все эти шаги, от определения структуры до биологической интерпретации, далеко не являются окончанием истории, часто являются началом новых структурных исследований: анализов относительной важности компонентов макромолекулы, аминокислот, путем определения структуры мутантов или исследований взаимодействий с др макромолекулами путем определения структуры макромолекулярных комплексов.