Сконструированы векторы для грамположительных бактерий, позволяющие уменьшать количество их копий на клетку(Renault et al., 1996). Эти векторы созданы на основе pILnew - малокопийного вектора, построенного на основе репликона pAMb1, несущего ген резистентности к эритромицину и способного реплицироваться в большинстве грамположительных бактерией. Этот вектор, как и все полученные из него производные, несут репликационный регион pAMb1, содержащий необходимый для репликации ген repE (кодирует белок репликации RepE) и его регулятор copF. Ген copF был инактивирован путём введения вставки в уникальный сайт Kpn I. Так как продукт copF оказывает репрессирующее действие на экспрессию repE, его инактивация ведёт к увеличению копий плазмид на клетку примерно в 20 раз. Первоначальное состояние малокопийности может быть восстановлено с помощью удаления вставки путём его вырезания из Kpn I и последующей сшивки. Вектор pILnew был использован для создания (1) клонирующих векторов, (2) векторов для изучения регуляции генов путём клонирования их промоторов и сайтов связывания с рибосомой, (3) векторов для экспрессии генов, (4) кассет, содержащих репликон с различными полилинкерами, которые способствуют созданию новых векторов.
Рис. 7. Структура векторов. Обозначения сайтов рестрикции: E (Eco RI); B (Bss HII); N (Nde I); K (Kpn I); B (Bgl II). Em и Cm – гены устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу, соответственно. repE – ген, кодирующий необходимый для репликации белок RepE; orfD – ген-регулятор транскрипции repE; сopF - ген репрессора (CopF) транскрипции кластера repE ‑ orfD; P orfD-repE - промотор кластера repE - orfD; P res - промотор гена резольвазы res b. MCSpBS-часть MCS плазмиды pBluescript; oriC - репликационный регион pBluescript.
Для того чтобы с помощью pILnew можно было осуществлять клонирование, в него был введён полилинкер в различной ориентации с образованием клонирующих векторов pJIM2278 и pJIM2279.
Сконструирован ряд векторов, позволяющих измерить активность промоторов с помощью бактериального люциферазного гена из Vibrio harvei в качестве гена-репортёра. Данный ген-репортёр обладает рядом полезных свойств: высокая чувствительность, возможность быстрого измерения активности, отсутствие фоновой активности в грамположительных бактериях. Были использованы два варианта генов люциферазы. В первом случае применялся кластер генов luxA и luxB (luxA/B), во втором - продукт слияния генов (luxAB). Преимущество системы luxA/B над luxAB заключается в её высокой термоустойчивости (luxAB инактивируется при температуре выше 37°C) и в отсутствии токсичности в E. coli, что позволяет создавать конструкции в этом удобном промежуточном хозяине перед их переносом в окончательного хозяина. Однако эти гены могут слабо транслироваться в некоторых грамположительных бактериях, и использование слитых luxAB генов значительно улучшает чувствительность системы в некоторых хозяевах.
Векторы pJIM2366 и pJIM2367 содержат luxA/B гены дистальнее полилинкера и двунаправленный терминатор his оперона Lactococcus lactis для предотвращения транскрипции с проксимально расположенных промоторов. В данных векторах было успешно протестировано ряд промоторов из L. lactis при низком и высоком числе копий вектора (промоторы оперонов mle, his и ald из L. lactis).
Активность многих генов регулируется на уровне трансляции. Поэтому была создана версия luxAB гена, позволяющая изучать эффективность сайтов связывания с рибосомой (RBS) для инициации трансляции. Для этого на уровне инициаторного кодона гена luxAB был введён сайт Nde I, что позволило осуществлять вставку RBS сразу перед стартовым кодоном этого гена. Транскрипция гена luxAB при этом может инициироваться с промоторов, расположенных проксимальнее. Вектор pJIM1715, содержащий слитый ген luxAB без RBS не проявлял люциферазную активность. В данный вектор была осуществлена вставка различных фрагментов гена aldB L. lactis, RBS (конструкция pJIM1723), RBS и анти-RBS (pJIM1728), а также RBS и промотор данного гена (pJIM1726). Данные, полученные с помощью указанных конструкций, показали, что pJIM1715 можно успешно использовать для изучения трансляционной эффективности RBS.
Часто необходимо, чтобы синтез продукта гена шёл на определённом уровне. Для достижения этого можно использовать регулируемые промоторы различной силы. Изменение дозы гена предоставляет дополнительный уровень контроля экспрессии гена. Чтобы показать, что для этой цели можно использовать производные pILnew, в pJIM2279 была осуществлена вставка lux генов и была измерена люциферазная активность при низком и при высоком числе копий вектора. При этом сначала измерялась активность экспрессии с промоторов расположенных в pJIM2279 проксимальнее MCS (промотор кластера orfD-repE и промотор гена резольвазы), а затем с промоторов клонированных в pJIM2366 и pJIM2367(см. выше). Данные показали, что наблюдается чёткая корреляция между дозой гена (количество копий вектора на клетку) и уровнем люциферазной активности. Был сконструирован клонирующий вектор pJIM2375, содержащий промотор mleS для конститутивной экспрессии на среднем уровне в L.lactis, RBS и сайт для клонирования Nde I.
На основе pILnew были созданы производные векторов pJIM2278 и pJIM2279, в которых репликон pILnew может быть отделён от маркера резистентности путём разреза одной рестриктазой в уникальном сайте рестрикции. На основе этого репликона можно затем создавать новые векторы несущие различные маркеры или гены-репортёры.
pJIM2244 и pJIM2245 являются производными pJIM2279, содержащими гены устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу соответственно. В этих конструкциях из всего полилинкера pJIM2279 оставлен единственный сайт Eco RI (в pJIM2245 также часть MCS плазмиды pBluescript). pJIM2241 и pJIM 2246 являются EmR и Cm R производными pJIM2278 соответственно и содержат большую часть полилинкера pJIM2278 на конце BssH II фрагмента содержащего репликон. Первые две плазмиды созданы для восстановления репликона pILnew без дополнительных сайтов рестрикции. Другие две плазмиды позволяют менять маркер, в то время как гены, клонированные в полилинкере, остаются связанными с репликоном.