Репликация с образованием D-петель
Особый тип поведения репликативной вилки идентифицирован в некоторых митохондриях (в первую очередь митохондриях млекопитающих). Репликация начинается в специфической точке начала репликации в кольцевой двухцепочечной молекуле ДНК.

Рис. 4.12
| Репликация митохондриальных ДНК млекопитающих начинается в специфической точке OriR. Cинтез инициируется путем образования праймерной РНК.
|
Первоначально только одна цепь (H-цепь в митохондриях млекопитающих) используется как матрица для синтеза новой цепи. Синтез происходит только на коротком участке и вызывает вытеснение исходной комплементарной L-цепи, которая остается одноцепочечной. Данное явление было названо вытеснением (displacement), а образующаяся структура – D-петлей. В митохондриях млекопитающих единственная D-петля стабильна и состоит из 500-600 оснований. Синтез короткой цепи, имеющей уникальный 5/-конец инициируется посредством образования праймерной РНК, а вариабельный 3/-конец формируется, по-видимому, в результате терминации синтеза в любом из 3-4 дискретных сайтов. Праймер не достаточно стабилен и может деградировать, а затем синтезироваться заново для сохранения в локусе OriR двойной спирали в открытой форме.
1. Некоторые митохондриальные ДНК, например, у Xenopus laevis (шпорцевая лягушка) имеют одну большую D-петлю.
2. Другие ДНК могут иметь несколько D-петель. Например, в линейной митохондриальной ДНК Tetrahymena (инфузория) обнаружено шесть D-петель.
3. Такой же механизм репликации используется в хлоропластной ДНК, где у высших растений образуются две D-петли.
Репликация митохондриальной ДНК млекопитающих происходит посредством присоединения дезоксирибонуклеотидов к 3/-концу короткой затравочной цепи, которая при этом удлиняется в D-петле. Вытесняемая часть L-цепи становится длиннее и расширяет D-петлю. Расширение продолжается до тех пор, пока не достигнет точки, находящейся на расстоянии 67% длины кольца. Удвоение этой области приводит к раскрытию точки начала репликации в L-цепи. В сайте OriD инициируется синтез Н-цепи, протекающий в противоположном направлении с использованием вытесненной L-цепи в качестве матрицы. Таким образом, раскрытие спирали не обязательно ведет к инициации репликации одновременно на двух материнских цепях ДНК. Структуры D-петель образуются в тех случаях, когда в кольцевых ДНК точки начала репликации двух цепей разделены некоторым расстоянием.

Рис. 4.13
| В митохондриальной ДНК млекопитающих имеются отдельные точки начала репликации для каждой из цепей (репликация L-цепи инициируется в точке OriR, а синтез новой Н-цепи начинается в точке OriD. Образующиеся D-петли представляют собой стабильные структуры.
|
Из-за задержки в инициации репликации второй цепи ДНК, дочерняя H-цепь синтезируется только на 30-40% длины кольца к моменту завершения синтеза дочерней L-цепи. В результате освобождается одна полная двухцепочечная кольцевая ДНК и одна кольцевая молекула, содержащая брешь. Далее брешь заделывается и остающиеся разрывы сшивается с участием лигаз.
|
I. Репликация ДНК E. coli
Казалось, что более 90% ДНК-полимеразной активности обнаруживаемой в экстрактах клеток E. coli могло быть приписано ДНК-полимеразе I. Однако, вскоре после выделения этого фермента в 1955 году стало очевидным, что ДНК-полимераза I не подходит на роль фермента способного осуществить репликацию крупной хромосомы E. coli. Во-первых, скорость, с которой ДНК-полимераза I добавляет нуклеотиды к 3/-концу растущей цепи ДНК (600 нуклеотидов/мин) является слишком малой, чтобы объяснить скорость движения репликативной вилки при удвоении ДНК в бактериальной клетке. Во-вторых, ДНК-полимераза I обладает относительно низкой процессивностью. В-третьих, результаты генетических экспериментов показали, что в процессе репликации участвует множество генов (другими словами множество дополнительных белков) так, что ДНК-полимераза I не может сама по себе обеспечить удвоение ДНК. В-четвертых, что наиболее важно, в 1969 году John Cairns получил необычный штамм E. coli с измененным геном ДНК-полимеразы I, который экспрессировал каталитически неактивный фермент. Несмотря на то, что этот штамм оказался чрезвычайно чувствительным к действию химических агентов повреждающих ДНК, тем не менее, он был жизнеспособным.
Поиски других ДНК-полимераз в клетках E. coli привели к открытию в начале 70-х годов ХХ столетия двух других бактериальных ферментов – ДНК-полимеразы II и ДНК-полимеразы III. Изучение свойств указанных ферментов позволило установить, что ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК определенного типа, в то время как ДНК-полимераза III оказалась основным ферментом репликации ДНК E. coli. Отличительные свойства всех трех ДНК-полимераз приведены в табл. А. ДНК-полимеразы IV и V, идентифицированные в 1999 году принимают участие в специфических процессах репарации ДНК.
Таблица А
Сравнительная характеристика ДНК-полимераз E. coli
| ДНК-полимераза
|
I
| II
| III
|
Структурный ген*
| polA
| polB
| polC (dnaE)
|
Число различных видов субъединиц
|
|
|
≥10
|
Молекулярная масса
| 103.000
| 88.000†
| 791.500
|
3/®5/-экзонуклеазная корректирующая активность
|
+
|
+
|
+
|
5/®3/-экзонуклеазная активность
|
+
|
–
|
–
|
Скорость полимеризации (нуклеотидов/сек)
|
16-20
|
|
250-1000
|
Эффективность (процессивность) (количество добавленных нуклеотидов до отсоединения полимеразы)
|
3-200
|
1.500
|
≥500.000
|
* для ферментов включающих более одной субъединицы, приведенные в таблице обозначения генов относятся только к полимеризующей активности. Обратите внимание на то, что обозначение dnaE является несколько устаревшим обозначением принятого в настоящее время символа polC.
† молекулярная масса указана только для полимеризующей субъединицы. ДНК-полимераза II имеет несколько общих с ДНК-полимеразой III субъединиц, включая: b, g, d, d/, c и y-субъединицы.
Таким образом, ДНК-полимераза I не является основополагающим ферментом репликации, вместо этого он выполняет массу «подчищающих» функций, принимая участие в процессах репликации, рекомбинации и репарации. Более того, специфические функции данного фермента расширяются благодаря его специфической 5/®3/-экзонуклеазной активности. Данная активность в отличие от корректирующей 3/®5/-экзонуклеазной активности связана с отдельным структурным доменом, который может быть отщеплен от интактного фермента посредством мягкого протеолиза. После отщепления 5/®3/-экзонуклеазного домена образующийся так называемый большой фрагмент ДНК-полимеразы I или фрагмент Кленова (мол. масса 68.000 Да) сохраняет полимеразную и корректирующую 3/®5/-экзонуклеазную активности. Специфическая 5/®3/-экзонуклеазная активность интактной ДНК-полимеразы I ответственна за замещение небольших сегментов ДНК (РНК) спаренных с матричной цепью в процессе так называемой nick-трансляции. Характерно, что другие ДНК-полимеразы утратили 5/®3/-экзонуклеазную активность.
Основной фермент репликации ДНК у E. coli – ДНК-полимераза III является гораздо более сложно устроенным, чем ДНК-полимераза I комплексом, включающим 10 разных видов (типов) субъединиц (табл. В) (рис. 1). Полимеризующая и корректирующая активности этого фермента связаны с его a- и e- субъединицами, соответственно. Субъединица q взаимодействуя с a- и e- субъединицами образует кор-фермент, который способен катализировать реакцию полимеризации, но с ограниченной эффективностью. Два кор-фермента могут быть соединены с другим набором субъединиц: g-комплексом, состоящим из семи субъединиц шести различных типов – t 2 gdd/cy, который способствует значительному увеличению процессивности полимеразы. (Мерой процессивности ДНК-полимеразы является длина фрагмента вновь синтезированной макромолекулы, которую фермент способен образовать в одном цикле, не диссоциируя от матрицы). За процесс сборки холофермента и его димеризацию отвечают t-субъединицы. Субъединицы t и g кодируются одним и тем же геном, однако g-субъединица является укороченным вариантом субъединицы t. Таким образом t-субъединица включает домен идентичный g и дополнительный сегмент ответственный за связывание с кор-ферментом. Полный ансамбль из 13 белковых субъединиц девяти (9) различных видов обозначают ДНК-полимеразой III*.

Рис. 1
| Строение ДНК-полимеразы III E. coli. Показано, что холофермент ДНК-полимеразы III включает два домена, представленных кор-ферментами состоящими из субъединиц a, e и q. Два кор-фермента связаны в димер с помощью g-комплекса построенного из семи субъединиц шести различных типов – t2gdd/cy (субъединицы c и y не показаны). Субъединицы t и g кодируются одним и тем же геном, однако g-субъединица является укороченным вариантом субъединицы t. Таким образом t-субъединица включает домен идентичный g и дополнительный сегмент ответственный за связывание с кор-ферментом. С каждым кор-субансамблем взаимодействует так называемый b-«скользящий зажим» состоящий из двух b-субъединиц. В целом холофермент ДНК-полимеразы III связан с dnaB-геликазой с помощью субъединицы t. PDB ID 2POL
|
ДНК-полимераза III* способна полимеризовать ДНК, но с намного более низкой процессивностью, чем необходимо для удвоения всей хромосомы E. coli.
Таблица В
Характеристика субъединиц ДНК-полимеразы III E. coli
Субъединица
| Число субъединиц в холоферменте
| Молекулярная масса субъединицы
| Ген
| Функции субъединиц
|
a
|
| 129.900
| polC
(dnaE)
| полимеразная активность
|
кор-фермент
|
e
|
| 27.500
| dnaQ
(mutD)
| 3/→5/-экзонуклеазная корректирующая активность
|
q
|
| 8.600
| holE
|
|
t
|
| 71.100
| dnaX
| стабилизация связывания с матрицей, димеризация кор-фермента
|
g-комплекс, который обеспечивает взаимодействие b-субъединиц вокруг отстающей цепи в каждом фрагменте Оказаки
|
g
|
| 47.500
| dnaX*
| формирование «скользящего зажима»
|
d
|
| 38.700
| holA
| открывает «скользящий зажим»
|
d/
|
| 36.900
| holB
| формирование «скользящего зажима»
|
c
|
| 16.600
| holC
| взаимодействие с SSB-белками
|
|
y
|
| 15.200
| holD
| взаимодействие с g и c
|
|
b
|
| 40.600
| dnaN
| «скользящий зажим» ДНК для оптимальной процессивности
|
|
* g-субъединица кодируется частью гена субъединицы t так, что 66% N-концевой последовательности t совпадает с полной аминокислотной последовательностью g. g-субъединица образуется путем сдвига рамки считывания, что приводит к ранней терминации трансляции.
Увеличение процессивности фермента достигается путем присоединения 4-х b-субъединиц на каждый холоэнзим ДНК-полимеразы III. b-субъединицы взаимодействуют попарно с образованием кольцеобразной структуры, которая обхватывает ДНК и действует на подобие «хомута». Каждый димер взаимодействует с субансамблем кор-фермента ДНК-полимеразы III* и «скользит» вдоль ДНК в ходе репликации. «Скользящий зажим» препятствует отделению полимеразы от молекулы ДНК, существенно увеличивая тем самым процессивность вплоть до 500.000 добавленных нуклеотидов.
Поиск по сайту: