Экспресс-диагностика чумы

Возбудитель чумы был открыт в 1894 году в Гонконге А.Иерсеном и в его честь был назван Yersinia pestis. К роду иерсиний относятся также Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, вызывающие септические гастроэнтероколиты или иерсиниозы.

Чума – особо опасная, очень тяжелая кровяная инфекция, склонная к широкому распространению и дающая высокий процент смертности (от 20 до 100%). Это зоонозная трансмиссивная природно-очаговая инфекция. Источники - крысы, суслики, песчанки, полевки, сурки, мышевидные грызуны.

Переносчики - кровососущие насекомые.

В составе бактерий чумы содержится более полутора десятков специфических и групповых антигенов. Переболевшие приобретают пожизненный, устойчивый иммунитет фагоцитарного характера.

Материал для исследования: содержимое бубонов, отделяемое язв, мокрота, кровь, испражнения.

Метод бумажных индикаторных систем. Классические методы (посев на среды Гисса) громоздки, требуют много времени и большого количества питательных сред, имеющих ограниченный срок годности. В настоящее вре­мя эти методы не удовлетворяют запросам противочумной сис­темы. В настоящее время наибо­лее перспективным методом определения ферментативной активности штаммов возбудителя чумы с целью идентификации выделяемых культур и изучения их свойств можно считать метод углеводно-бумажных дисков, предложенный В.М.Никитиным и С.В.Плугару. В качестве среды лучше использовать бульон Хоттингера, т.к. он дает наиболее быструю ферментацию – 3 часа. Целе­сообразно применять БИС в полевых условиях, так как наборы компактны и могут длительное время храниться при комнатной температуре.

Фаготипирование. 1. Внесение бактериофага в исследуемый материал в момент его посева на агар с генцианвиолетом позволяет обнаружить под микроскопом негативные колонии фага или «дорожку» в первые часы, когда рост бактерий еще почти не заметен (через 2,5 – 3 часа). Метод прост, доступен и дает хорошие результаты при высокой концентрации чумного микроба и при относительно большом содержании посторонних микроорганизмов.

2. Определение нарастания титра чумного фага, вносимого в исследуемый материал, где в случае наличия возбудителя фаг начинает размножаться уже через 30-40 минут. В жидкий исследуемый материал (25-50-100 мл) и в контрольную жидкость добавляют столько фага, чтобы получить его разведение 1:50 – 1:100; ставят пробы в термостатах при 37⁰C на 45-60 минут. После инкубации берут 0,5 мл жидкости из каждой пробы и разводят бульоном в 10 раз; из этого первого разведения фага готовят серию последовательных 10-кратных разведений (до 10^-10 – 10^-11). По 0,5 мл жидкости из каждого разведения исследуемого и контрольного рядов добавляют к 2,5 мл полужидкого агара (0,1%), предварительно расплавленного и затем охлажденного до 48-50⁰С. Тут же к агару добавляют 0,1 – 0,2 мл взвеси 1 – 2 суточной индикаторной культуры (вакцинный штамм чумного микроба), содержащий 15-20 млрд микробов в 1 мл. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выливают на чашки Петри с 2% агаром Хоттингера. После того, как полужидкий агар застынет, чашки перевертывают дном кверху и ставят в термостат при 37⁰С. Учет результатов производят через 3-4 часа. На фоне сплошного роста индикаторной культуры видны стерильные пятна (негативные колонии фага), количество которых на чашках с исследуемым материалом может превосходить в 100-1000 и более раз число негативных колоний на контрольных чашках. Благодаря хорошей диффузии фаговых частиц и бактериальных клеток через полужидкий агар двухслойный метод дает стерильные пятна большего размера, чем при размазывании исследуемой массы шпателем по поверхности агара. Подсчет колоний ведут в счетной камере.

А также: РИФ, РПГА и др.

Некоторые другие методы

Хемилюминесцентный иммуноанализ. Новым этапом на пути развития иммунологических методов диагностики ООИ является хемилюминесцентный иммуноанализ — ХЛИА. Преимущество этого метода определяется его высокой чувствительностью, относительной простотой и произ­водительностью, возможностью полной автоматизации

В открытой литературе имеются отдельные сообщения, по­священные применению ХЛИА в медицинской микробиологии, как для обнаружения бактериальных антигенов, так и для поиска специфических антител

Цель нашей работы заключалась в отработке оптимальных условий постановки ХЛИА для ускоренной диагностики ООИ, сравнительной оценке этого теста с общепринятыми реакция­ми — МФА, РПГА и ТИФА.

Объектами исследования служили взвеси возбудителей чу­мы, сапа, мелиоидоза, бруцеллеза и сибирской язвы, обезза­раженные 0,5% формалином, всего 100 штаммов.

Специфичность препаратов и метода контролировали на 42 штаммах близкородственных и гетерологичных микроорга­низмов.

В качестве диагностических препаратов для обнаружения возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, бруцеллеза и сибирской язвы в ТИФА и ХЛИА использовали специфические иммуно-пероксидазные конъюгаты к соответствующим возбудителям ООИ, полученные методом перйодатного окисления на основе иммуноглобулинов из кроли­чьих иммунных сывороток и пероксидазы, рабочее разведение которых составляли соответственно 1:200—1:300 и 1:1000—1:1500.Подготовку и постановку ТИФА и ХЛИА осуществляли общепринятым способом В качестве субстратов использовали: для ТИФА — о-фенилендиамин, для ХЛИА — смесь люминола с перекисью водо­рода и р-йодфенола. Постановку МФА и РПГА проводили по общеизвестной ме­тодике.

Результаты ТИФА и РПГА учитывали визуально, МФА — при помощи люминесцентного микроскопа, ХЛИА — на люминометре.

Чувствительность ХЛИА на 1—2 по­рядка выше, чем ТИФА и на 2—4 порядка превышает чувстви­тельность общепринятых тестов — МФА и РПГА. При этом ме­тод достаточно специфичен.

Хемилюминесцентный анализ при использовании автомати­ческих приборов постановки и учета результатов отличается экономичностью и высокой разрешающей способностью, за­служивает внедрение в практику медицинских и ветеринарных лабораторий.

Специфичность ХЛИА зависит от качества использован­ных иммуноглобулинов. На 42 близкородственных и гетероло-гичных штаммах положительные реакции получены с Y. pseu-doTuberculosis 816111(37°) с чумными общими ИПК и В. sereus 1 и 3 с сибиреязвенными ИПК в концентрациях 1 -106 м. т./мл.

ХЛИА следует рекомендовать для лабораторной диаг­ностики ООИ особенно в тех случаях, когда в исследуемом ма­териале предполагается незначительное содержание возбуди­теля.

Иммуноблотинг. Иммуноблоттинг — разновидность гетерогенного иммун­ного анализа. Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, исполь­зуемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специ­фическое выявление.

В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК,— РНК и белок — блоттинг.

При постановке иммуноблоттинга соблюдается следующая методическая последовательность: электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение реплики путем блоттинга белков или полипептидов с геля на твердофазный матрикс; блокирование фона, отмывка от компонентов, используемых при блокировании фона; инкубирование со спе­цифической тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с Jg к антителам специфической тест-сыворот­ки, конъюгированными с меткой; отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых антигенов авторадиографически или ферментативно по реакции с соответствующим субстратом.

Иммунохимическое выявление антигенов можно прово­дить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В ка­честве метки в последнее время широко применяют либо ра­диоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелоч­ную фосфатазу, лактамазу и др.).

Время блоттинга путем диффузии составляет 36—48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей — электроблот, время которого, в основном, составляет 1—3 ч (2), для некоторых высокомолекулярных белков— более 12 ч.

Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит от анти­гена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследо­вания.

Метод ИБ по целому ряду обстоятельств получил наиболь­шее распространение как метод, пригодный для использования в качестве теста подтверждения.

Безусловное достоинство метода — возможность тести­рования антител к слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в анти­гены.

О чувствительности в случае ИБ судят по предельному коли­честву нанесенного на гель антигена, которое при фракциони­ровании белков удается выявить иммунохимически после пере­носа с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу). Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на твердом но­сителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител. Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее выявления.

Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет иденти­фицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.

Обнаружение возбудителей, антигенов и антител при помощи суспензионных препаратов. Принцип: фиксированные на частицах компоненты вступают в реакцию антиген-антитело, которая сопровождается образованием крупных, видимых невооруженным глазом агломератов.В суспензионных препаратах для обнаружения и количествен­ного определения антигенов и антител используется свойство мно­гих неорганических и органических веществ, таких как активиро­ванный уголь, дерматол, бентонит, каолин, гидроокись алюминия, силикаты, сульфат бария, полистирол и т. д. физически сорбировать биополимеры на своей поверхности.

В. Никитина применила цветные целлюлозные антигены для ускоренной диагностики чумы и туляремии, которые за 5—10 ми­нут дают возможность в реакции непрямой агглютинации обнаружить иммунные антитела. Eisler показал, что животный уголь адсорбирует антитела против холерного гемолизина. Величина адсорбции антигемолизинов зависит от титра антигемолитической сыворотки. Животный уголь интенсивно адсорбирует антигемолизины из сывороток с не­высоким титром антител. С возрастанием титра антигемолитических сывороток интенсивность адсорбции антигемолизинов углем уменьшается. Древесный уголь или частички химически чистого угля могут быть использованы как носители антител аналогично латексу и бентониту. Препараты типа угольных сывороток обладают двумя ценными свойствами: они сохраняются длительное время в сухом виде и не нуждаются в до­бавлении консервантов. Как пока­зали исследования Р. X. Яфаева, антитела могут быть фикси­рованы на поверхности частиц активированного угля адгезионным методом — путем прикрепления антител к частицам пленкой де­натурированного белка. Суспензия частиц угля, содержащая ад­сорбированные антитела специфически агломерирует при добавле­нии к ней гомологичного антигена.

Использование анионообменной смолы в качестве носителя ан­тител нашло применение при обнаружении возбудителей холеры и везикулярного стоматита. Частицы смолы, соединенные с анти­телами, агглютинируют при добавлении материала, содержащего специфический антиген.

Заключение

Существует большое разнообразие методов экспресс-диагностики особо опасных инфекций, основанных на различных принципах. Выбор того или иного должен производится в соответствии с техническими возможностями лаборатории, контингентом зараженных людей, характером и масштабом распространения предполагаемой инфекции. Диагностику необходимо провести в наиболее короткие сроки, так как от этого зависит эффективность изоляции и лечения больных. При работе с патологическим материалом важно учитывать и предупреждать возможность заражения медицинского персонала, поэтому надо строго соблюдать инструкции по сбору материала от больных.

Классические методы экспресс-диагностики в большинстве своем исчерпали себя, в связи с этим необходимо разрабатывать принципиально новые, такие как ПЦР и др. и автоматизировать существующие.

Таким образом, экспресс-диагностика ООИ и по сей день остается актуальной и одной из важнейших задач микробиологии и эпидемиологии.

Список использованной литературы

1. Ускоренные методы диагностики инфекционных болезней (сб. тр.) –Кишинев, «ШТИИНЦА», 1987.

2. Препараты для экспресс-диагностики (сб. тр.) – Ленинград, 1981.

3. Иммунохимия и лабораторная диагностика особо опасных инфекций (сб. тр.) – Саратов, 1985.

4. Щербак Ю.Ф. Особо опасные инфекции – М., «Медицина», 1975.

5. Ранняя и дифференциальная диагностика основных инфекционных заболеваний (уч.-мет. пособие) – Ленинград,1988.

6. Медицина катастроф (уч. пособие) – М., «ИНИ Лтд», 1996.

7. Лебедева М.Н. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии – М., «Медицина», 1973.

8. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии – М., «Медицина», 1993.

9. Повлович С.А. Медицинская микробиология в графах – Минск, «Вышэйшая школа», 1986.