Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫИ БИОЛОГИИ
КАФЕДРА БИОХИМИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ
Направление: 06.03.01 – биология
КУРСОВАЯ РАБОТА
МикроРНК в геноме криптобиотического насекомого Polypedilum vanderplanki.
Студент 3 курса
Группа 01-505
"___"_________ 2018 г. ____________________ (А.Р. Мингалеев)
Научный руководитель
к.б.н., доцент
"___"_________ 2018 г. ___________________ (О.С. Козлова)
Казань – 2018
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………….3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………..4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………….……………………………..5
1.1. МикроРНК……………………………………………………………………….5
1.1.1. Биогенез микроРНК……………………………...………………………....…5
1.1.2. Функции микроРНК……………………………………………………...…...7
1.1.3. Методы определения и исследования микроРНК………………………….8
1.2. Polypedilum vanderplanki как модель изучения ангидробиоза ……....…....9
1.2.1. Ангидробиоз Polypedilum vanderplanki: ответ на стресс…………………9
1.2.2 Механизмы ангидробиоза Polypedilum vanderplanki ………....……....…....10
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ …………………………………………….11
2 МАТЕРИАЛЫИ МЕТОДЫ ……………………………………………....11
2.1 Исходные чтения микроРНК ……………………..……………..……....…11
2.2 Контроль качества и предварительная обработка чтений...…………...…...11
2.3 Выравнивание чтений на геном P. vanderplanki и предсказание микроРНК.12
2.4 Анализ дифференциальной экспрессии микроРНК………………………..12
2.5 Поиск генов-мишеней.………………………..15
3 РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………..18
ВЫВОДЫ …………………………………………………………………………..27 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ …………………………...28
BBЕДЕНИЕ
МикроРНК – обширный класс некодирующих РНК длиной 18-25 п.н. Данные РНК имеют большую роль при регуляции на уровне транскрипции, а также постранскрипционном уровне. Исследование регуляции имеет важное значение для понимания эволюции: различия между видами и более крупными таксонами обусловенны не столько структурными генами, сколько регуляторными элементами в геноме. Важным является не только, какие гены экспрессируются, но и в какой момент времени это происходит.
Изучение некодирующих РНК в комаре вида Polypedilum vanderplanki представляет интерес с теоретической точки зрения, как расширение фундаментальных представлений о геноме насекомых, что может пролить свет на эволюцию отряда двукрылых(Diptera) и,возможно, на класс в целом.
Особенностью комара Polypedilum vanderplanki является способность его личинок к ангидробиозу - полному высыханию. С помощью неё личинки способны жить в водах с температурой +60…+70 °C и полностью высохших водоемах. В данном состоянии личинки способны выживать при высоких перепадах температур (−170 °C... +106°C), а также выдерживать очень высокие значения гамма-излучения (до 7000 Грей). Данная способность имеет практический интерес, с точки зрения разработки новых и дешевых методов хранения клеточных линий: использование криозаморозки является достаточно дорогим и имеет значительные ограничения при транспортировке в силу высокого риска повреждения клеток при разморозке.
Цель:
Провести анализ данных секвенирования микроРНК клеточной линии Pv11 в контрольных и обработанных трегалозой образцах
Задачи:
1. Выявить в геноме P.vanderplanki участки, кодирующие микроРНК
2.Исследовать расположение этих участков относительно белок-кодирующих генов
3.Провести анализ дифференциальной экспрессии микроРНК.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК – Дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК – Рибонуклеиновая кислота
мРНК – матричная РНК
BCV – Biological coefficent variation
GLM – Generalized linear model
LEA – Late Embryogenesis Abundant
PCR – polymerase chain reaction
RT-PCR – PCR с обратной транскриптазой
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 МикроРНК
1.1.1 Биогенез микроРНК
МикроРНК (англ. miRNA) – это большой класс некодирующих РНК длиной от 18 до 25 п.н., участвующий в регуляции экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровне.
Гены микроРНК могут располагаться как в межгенных участках генома, так и внутри белок-кодирующих генов (в интронах) или внутри длинных некодирующих РНК. Синтез микроРНК начинается в ядре с первичных микроРНК (англ. pri-miRNA), которые синтезируются РНК-полимеразами II и III и, подобно белок-кодирующим транскриптам, кэпируются, полиаденилируются и сплайсируются. Следующий этап – образование предшественников микроРНК (англ. pre-miRNA) – происходит за счёт ядерного комплекса, в состав которого входят белки, распознающие первичную микроРНК и связывающиеся с ней (DiGeorge Critical Region 8 – у позвоночных, Pasha – у беспозвоночных), а также белок Drosha, разрезающий нить предшественника, в результате чего из одной первичной микроРНК длиной несколько сотен п.н. может образовываться несколько предшественников микроРНК длиной порядка 80 п.н. Предшественник микроРНК характерен наличием гидроксильной группы на 3’-конце и фосфатной группы – на 5’-конце. Его вторичная структура представляет собой шпильку.
После процессинга предшественники микроРНК выводятся в цитоплазму с помощью белкового комплекса Экспортин-5, где терминальная петля вырезается рибонуклеазой Dicer-1. В результате этого образуется двухцепочечная РНК с двумя свободными нуклеотидами на концах. Последний этап биогенеза микроРНК – преобразование короткой двухцепочечной РНК длиной 20-25 п.н. в зрелые однонитиевые микроРНК, каждая из которых, потенциально, может участвовать в процессе регуляции.
1.1.2 Функции микроРНК
Наиболее общие представления о регуляции экспрессии генов посредством микроРНК сводятся к понятию РНК-интерференции, в процессе которой микроРНК комплементарно связываются с участком РНК-мишени и репрессируют трансляцию за счёт механизмов, остающихся на сегодняшний день не до конца изученными. Принято считать, что у растений связывание происходит в кодирующей части гена, при этом зрелая микроРНК полностью или почти полностью комплементарна целевому участку [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18483398], в то время как у животных микроРНК связывается в 3’-нетранслируемой области гена, и полное комплементарное соответствие вовсе не обязательно: так, для эффективного связывания достаточно фрагмента длиной от 6-8 нуклеотидов (в англоязычной литературе этот участок называется seed region и обычно является высококонсервативным). Таким образом, у одной и той же микроРНК может быть несколько мРНК-мишеней и, напротив, одна и та же мРНК-мишень может быть регулируемой более чем одной микроРНК [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652477].
Однако из литературы известна также способность
1.1.3. Методы определения и исследования микроРНК
Наиболее общие представления о регуляции экспрессии генов посредством микроРНК сводятся к понятию РНК-интерференции, когда микроРНК связывается комплементарно с участком РНК-мишени в её 3’-нетранслируемой области, несмотря на то, что её способность связываться с 5’-нетранслируемой областью также известна из литературы [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17535905].
Примечательно, что, в зависимости от условий, одна и та же микроРНК
способна не только снижать синтез целевого бека, так и, напротив, усиливать его [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18048652], и, таким образом, регуляция генетической экспрессии за счёт микроРНК имеет более сложный характер и не сводится к одной лишь РНК-интерференции.
Данные о существовании феномена РНК-обусловленного замолкания генов были получены в 90-ые годы в опытах с петунией, когда Рич Йоргенсен с коллегами интродуцировал в геном этого растения халкон-синтазный ген с целью усиления пурпурной окраски цветков. При этом структурная часть этого гена вводилась и в смысловой, и антисмысловой ориентации. Последнее было использовано в качестве контроля.
Результат оказался неожиданным. В трансгенных растениях окраска цветков вне зависимости от ориентации интродуцированного гена не усилилась, а напротив, исчезла. При этом подавлялась функция не только интродуцированного гена, но и его эндогенного гомолога. [Napoli, et. al., 1990]. Это явление получило название РНК-зависимого замолкания генов или косупрессии.
Аналогичные результаты были получены у грибов Neurospora crassa в 1992 г. Исследователи назвали это подавлением функции гена. Опыт показал, что, несмотря на происходящую транскрипцию “молчащих” генов, информационная РНК быстро деградирует и не накапливается в цитоплазме [Romano, Macino, 1992].
Однако функция микроРНК заключается не только в этом. Так, микроРНК, в отличие от коротких интерферирующих РНК, могут связываться с другими некодирующими РНК. Их влияние на регуляцию не является дискретным, напротив, изменение экспрессии генов-мишеней можно охарактеризовать как плавное и непрерывное [Ninova, et al., 2016; Akhtar, et al., 2015; Mott, Mohr, 2016].
Было также обнаружено, что микроРНК, наряду с другими некодирующими РНК, играют важную роль на самых ранних этапах
эмбриогенеза многих организмов, в том числе и многих беспозвоночных.
Также интересной представляется их роль в регуляции таких процессов, как апоптоз, митотический цикл, контроль мобильных элементов, клеточная дифференцировка. Кроме того, замечена связь с развитием злокачественных опухолей [Малек, Берштейн, 2015; Pashkovskiy, Ryazansky, 2013; Ninova, et al., 2014; Sekhar, et al., 2016]. Среди микроРНК есть как эволюционно консервативные, так и варианты с высокой скоростью эволюции, сопоставимой по скорости с некодирующими участками в ДНК. Это может указывать на древность и функциональную значимость первых, а также на наличие появившихся “недавно” микроРНК, накапливающих изменения путем дрейфа [Peterson, et al., 2009].
Способность тонко и направлено регулировать экспрессию генов дало морфологическое разнообразие. Появление новых микроРНК могло способствовать ароморфозам и значительным морфологическим изменениям [Бойко с соавт., 2011; Wheeler, et al., 2009].
1.1.2. Методы определения и исследования микроРНК
Большая часть исследований о роли микроРНК в развитии организмов была получены на мухах-дрозофилах. Однако, несмотря на все преимущества данного модельного объекта, у него есть существенные недостатки. Эмбриональное развитие плодовых мух с длинной чередой превращений является вторичным и крайне специфичным вариантом развития организма, характерного для насекомых с полным превращением [Ninova, et al., 2016].
Таким образом, можно сделать вывод, что исследование микроРНК не должно ограничиваться только таким модельным объектом, как дрозофила. Для понимания эволюции живой материи, в частности, насекомых, необходимо работать с разными видами.
Изучение механизмов, в которых задействованы микроРНК у различных групп видов, может помочь в разработке и оптимизации методов генной терапии [Т. Д. Лебедев c соавт., 2012; Pecot, et al., 2011; Gulnihal, et al., 2015].
Способ количественного определения микроРНК заключается в двухшаговой полимеразной цепной реакции (ПЦР): первый этап – ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR), а второй – ПЦР в реальном времени (real-time-PCR) [Kajal, Singh, 2017]. Определение микроРНК также возможно на микрочипах [Zhenqiang, et. al., 2014]: микроРНК гибридизуется со множеством мишеней микроРНК, и, таким образом, можно определить относительное содержание микроРНК в различных образцах. Также данный метод может быть использован для установления или уточнения функций исследуемой микроРНК.
Для определения новых последовательностей микроРНК используются методы высокопроизводительного секвенирования. При этом для изготовления библиотек микроРНК существуют коммерчески доступные наборы – например, набор для приготовления библиотек с целью последующего секвенирования на платформе Illumina NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set. Важным является определение уровня экспрессии микроРНК с целью изучения эффектов, которые они оказывают на данном уровне экспрессии в виду крайне сложного процесса определения микроРНК посредством высокопроизводительного секвенирования [Akhtar, et al., 2015], также для этого метода значителен процент ошибок.
Вычислительные методы выявления новых микроРНК, на самом деле, выявляют не их самих, а их предшественников. Недостатком такого подхода является невозможность определения зрелой микроРНК внутри её предшественника [Leclercq, et al., 2013].
1.2. Polypedilum vanderplanki как модель изучения ангидробиоза
Личинки Polypedilum vanderplanki, так же известные как хирономиды, среди немногих многоклеточных обладают способностью к ангидробиозу – способности выживать в состоянии почти полного
обезвоживания. В обезвоженном состоянии хирономиды способны переживать крайне неблагоприятные условия: радиацию, перепады температур, вакуум и.т.д[Шарипова, c cоавт., 2012; Gusev, et al., 2010; Sakurai, et al., 2008; Mitsumasu, et al., 2010; Chakraborty, et al., 2012].
Способность хирономид высушивать свои ткани, с последующим быстрым возвращением к нормальному функционированию [Gusev, Suetsugu, 2014], является интересным феноменом с практической точки зрения: большинство методов хранения, основанные на заморозке являются крайне дорогостоящими. Также недостатком данных методов является то, что при разморозке тканей высока вероятность повреждения последних[ Шарипова c cоавт., 2012].
1.2.2 Механизмы ангидробиоза Polypedilum vanderplanki
Суть процесса ангидробиоза заключается в замене молекул воды на трегалозу и другими биомолекулами, помогающие в “консервировании” тканей при высушивании [Mitsumasu, Kanamori, et al., 2010; Gusev, et al., 2010; Chakraborty et al., 2012].
В процессе обезвоживания и регидрирования важную роль играют белки теплового шока – многочисленный и разнообразный класс шаперонов, участвующий в контроле фолдинга белков [Gusev, et al., 2010]. Необходимы они в виду того, что при высыхании белки могут денатурировать и терять свою нативную структуру. Во избежание этого белки теплового шока направляют фолдинг для формирования правильной трехмерной структуры.
В процессе интенсивной потери воды, возможна агрегация белков. Во избежания этого, многие растения и беспозвоночные животные имеют особые белки, которые называются LEA-белки (от англ. L ate E mbryogenesis A bundant). Данные белки характерны для бактерий и растений, проходящих через стадию высушивания [Hundertmark, Hincha, 2008; Kushwaha, et al., 2012; Gusev, et al., 2014].
В процессе ангидробиоза, а также под воздействием высоких температур возможна химическая модификация аминокислот в белке. Одни из таких повреждений распознаются ферментом под названием Protein L-isoaspartyl methyltransferase или PIMT. Данный фермент катализирует реакцию переноса метильной группы, на L-изоаспартат и D-аспартат, восстанавливая поврежденные группы на белке [ Gusev, et al., 2014].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫИ МЕТОДЫ
2.1 Исходные чтения микроРНК
В работе были использованы 6 библиотек чтений микроРНК клеточной культуры Pv11, полученных в результате пробоподготовки с использованием набора NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set из тотальной РНК, выделенной с использованием набора Rneasy Mini kit (Qiagen). Образцы были секвенированы на платформе Illumina HiSeq 2500 в режиме одноконцевых чтений длиной 60 п.н. Библиотеки чтений соответствовали контрольным образцам и образцам после добавления трегалозы (имитация начальной стадии обезвоживания личинки в клетках), каждый из которых был представлен тремя репликами (K1, K2, K3 для контроля и Tr1, Tr2, Tr3 – для образцов, обработанных трегалозой). Количество чтений в библиотеках варьировало от 16.9 млн до 21.4 млн и в среднем составляло 19 млн чтений на библиотеку.
2.2 Контроль качества и предварительная обработка чтений
Прежде чем приступать к собственно обработке результатов высокопроизводительного секвенирования, необходимо провести контроль качества исходных чтений, поскольку ошибки и неточности в секвенировании могут крайне негативно сказаться на дальнейшей работе. В случае с микроРНК – малыми молекулами, которые обладают низкой стабильностью, контроль качества особенно важен, потому что если длина целевого фрагмента оказывается существенно меньше длины чтения, секвенатор начинает прочитывать последовательность адаптера – технической молекулы, необходимой для закрепления фрагмента на проточной ячейке. Нецелевые технические последовательности препятствуют выравниванию чтений на геном, а, следовательно, должны быть удалены.
Для контроля качества исходных последовательностей использовалась
программа FastQC [https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/], а удаление адаптеров проводилось с помощью программы Trimmomatic [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24695404].
2.3 Выравнивание чтений на геном P. vanderplanki и предсказание микроРНК
После удаления адаптеров из чтений они были объединены в один файл для выравнивания на геном P.vanderplanki в программном пакете miRDeep2 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3245920/] с использованием скрипта mapper.pl. Выравнивание (по-другому, картирование) представляет собой процедуру нахождения позиции чтения в геноме, результаты которой были использованы для предсказания микроРНК с помощью основного скрипта пакета miRDeep2 с одноимённым названием. Несмотря на то, что поиск генов микроРНК можно осуществлять и de-novo, не используя какой-либо информации о последовательностях микроРНК других близкородственных видов, с целью упрощения исследования функциональных особенностей найденных микроРНК, в процессе предсказания были использованы последовательности зрелых микроРНК из других отрядов насекомых. Они были загружены из базы данных miRBase и включали в себя последовательности плодовой мухи-дрозофилы (Drosophila melanogaster), шелкопряда (Bombyx mori), пчелы (Apis mellifera) и хрущака малого булавоусого (Tribolium castaneum).
2.4 Анализ дифференциальной экспрессии микроРНК
После того как было выполнено предсказание расположения генов микроРНК в геноме, был оценён уровень их экспрессии в каждом из шести образцов. С этой целью для каждого из образцов был запущен скрипт оценки уровня экспрессии quantifier.pl из программного пакета miRDeep2, посредством которого было подсчитано количество чтений, приходящихся на каждый ген микроРНК. Информация о количестве чтений, покрывающих
гены, была обработана в программной среде R с помощью пакета edgeR [Robinson MD, McCarthy DJ and Smyth GK (2010). “edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.”] и статистического метода обобщённых линейных моделей (Generalized linear model – GLM). GLM определяет распределения вероятностей в соответствии с их отношением средней к дисперсии, при этом в качестве дисперсии (биологического коэффициента вариабельности) для каждого гена выбиралась максимальная из трёх – общей (common), дисперсии тренда (trend) и внутригенной (tagwise). Дифференциально экспрессирующимися признавались гены, уровень экспрессии которых между образцами изменялся статистически значимо (p-value с поправкой на множественное сравнение Бенджамини-Хохберга <0.05).
2.5 Поиск генов-мишеней
Полноценный поиск возможных генов-мишеней для всех микроРНК, выявленных в геноме, нуждается в больших временных и вычислительных затратах, поэтому в качестве примера был выполнен поиск мишеней только для одной микроРНК, имеющей гомолог в геноме дрозофилы (dme-miR-1-3p) и достаточно хорошо изученной.
Поскольку классическим сценарием взаимодействия микроРНК с геном-мишенью остаётся связывание в 3’-нетранслируемой области, все такие участки в геноме P. vanderplanki были собраны в один файл в формате fasta, который в дальнейшем использовался для предсказания участков связывания, обеспечивающих минимальную энергию взаимодействия, в программе IntaRNA 2.0 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28472523]. В качестве seed-участка использовался консервативный 8-мер, наиболее характерный для данной микроРНК, согласно базе данных TargetScan.
РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате подсчета было выявлено, что на 4-ой хромосоме наименьшее кол-во микроРНК, также среди них статистически значимо недопредставлены микроРНК имеющие ортологи. На 4-ой хромосоме перепредставлено кол-во высокоэкспрессирующихся, а также дифференциально экспрессирующиеся микроРНК.
Таблица 1 – распределение микроРНК по геному Polypedilum vanderplanki
| I-chr | II-chr | III-chr | IV-chr | P-value(X2) | |
| Всего | 0.071 | ||||
| С ортологами | 0.006 | ||||
| Плотость (шт/Mb) | 0.9 | 0.6 | 1.31 | 1.16 | |
| с logCPM>5 (всего 52 шт) | 0.668 | ||||
| UP-regulated (всего 21 шт) | 0.523 | ||||
| logCPM>5 AND UP-regulated (всего 15 шт) | 0.022 | ||||
| TOP10 Up-regulated (по logFC) | 0.034 | ||||
| TOP20 Up-regulated(по logFC,>=1.8) | 0.33 |
Таблица 2 – Кластеры микроРНК по расположению в геноме.
| cluster1 | scaffold4_30314 | scaffold4_30317 | scaffold4_30319 | scaffold4_30321 | 1 kb |
| cluster2 | scaffold1_1143 | scaffold1_1146 | scaffold1_1148 | 0.5 kb | |
| cluster3 | scaffold2_16769 | scaffold2_16774 | scaffold2_16782 | 10 kb | |
| cluster4 | scaffold3_21803 | scaffold3_21805 | 0.3 kb | ||
| cluster5 | scaffold3_19761 | scaffold3_19763 | scaffold3_19765 | 1 kb | |
| cluster6 | scaffold1_862 | scaffold1_870 | 1.5 kb | ||
| cluster7 | scaffold2_12772 | scaffold2_12775 | 1 kb | ||
| cluster8 | scaffold3_24908 | scaffold3_24910 | 0.3 kb | ||
| cluster9 | scaffold1_5657 | scaffold1_5663 | 8kb |
Таблица 3 – данные по микроРНК: оценка экспрессии, ортологи, расположение относительно других генов, кластеры и предполагаемые мишени. Красным выделены статистически значимо повышающие экспрессию в группе обработанной трегалозой, синим – значимо понижающие.
| ID | logFC | logCPM | ortholog | location | cluster | gene | description |
| scaffold1_4564 | 5.66 | 3.51 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold4_30317 | 5.1 | 4.2 | URS000010CD08_7227__dme-miR-9c-5p | межгенник | cluster1 | - | - |
| scaffold4_30321 | 5.08 | 5.82 | - | межгенник | cluster1 | - | - |
| scaffold4_29374 | 4.31 | 5.21 | - | 3'UTR | одинаковый с scaffold4_29386 | g13340 | LEA |
| scaffold4_29386 | 4.31 | 5.21 | - | 3'UTR | одинаковый с scaffold4_29374 | g13341 | LEA |
| scaffold4_30314 | 3.95 | 9.73 | - | межгенник | cluster1 | - | - |
| scaffold4_30319 | 3.57 | 10.93 | - | межгенник | cluster1 | - | - |
| scaffold3_18950 | 3.24 | 1.74 | URS0000302FB5_7091_Bombyx_mori_(domestic_silkworm)_microRNA_bmo-miR-278-5p | интрон, antisense | - | g8880 | unknown |
| scaffold3_21421 | 3.01 | 0.81 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_25584 | 3.01 | 0.81 | URS00002A1726_7227__dme-miR-998-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_14804 | 2.97 | 0.79 | - | 5'UTR | - | g4677 | longitudinals lacking protein |
| scaffold4_29453 | 2.94 | 15.31 | - | 3'UTR | похож на scaffold4_29397 | g13350 | LEA |
| scaffold1_2640 | 2.87 | 1.57 | - | 5'UTR | - | g2540 | 5NUC |
| scaffold1_1148 | 2.72 | 3.86 | URS00004E6531_7227__dme-miR-5-5p | интрон, antisense | cluster2 | g1268 | aconitase |
| scaffold4_29397 | 2.68 | 10.54 | - | 3'UTR | похож на scaffold4_29453 | g13342 | LEA |
| scaffold2_16782 | 2.53 | 8.98 | URS00005995BF_7227__dme-miR-4943-3p | 5'UTR | cluster3 | g6898 | unknown |
| scaffold2_16769 | 2.5 | 13.23 | URS0000281B10_7227__dme-miR-34-5p | 5'UTR | cluster3 | g6898 | unknown |
| scaffold3_27719 | 2.14 | 2.48 | URS0000327691_7227__dme-miR-1002-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_17876 | 2.1 | 2.21 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold13_32472 | 1.84 | 1.52 | - | интрон | - | g16202 | unknown |
| scaffold3_26613 | 1.62 | 5.45 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_5040 | 1.6 | 2.12 | URS00004883E0_7227__dme-miR-133-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_26131 | 1.59 | 1.41 | URS000052DA91_7227__dme-miR-989-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold4_28402 | 1.43 | 5.44 | - | 5'UTR | одинаковый с scaffold4_28406 | g13499 | метилтрансфераза |
| scaffold4_28406 | 1.43 | 5.44 | - | межгенник | одинаковый с scaffold4_28402 | - | между метилтрансферазами |
| scaffold1_1143 | 1.33 | 8.24 | URS0000003085_7227__dme-miR-279-3p | интрон, antisense | cluster2 | g1268 | aconitase |
| scaffold3_21805 | 1.12 | 12.79 | URS0000003085_7227__dme-miR-279-3p | интрон | cluster4 | g11229 | HASPIN |
| scaffold3_19761 | 11.18 | URS00000D51AF_7227__dme-miR-308-3p | интрон | cluster5 | g9692 | phosphatase 4 | |
| scaffold2_16774 | 0.86 | 12.03 | URS00001B9842_7227__dme-miR-277-3p | 5'UTR | cluster3 | g6898 | unknown |
| scaffold3_21543 | 0.85 | 6.17 | URS00000384A0_7227__dme-miR-970-3p | интрон | - | g11063 | syntaxin-binding protein |
| scaffold3_20075 | 0.79 | 11.72 | URS000029C35A_7227__dme-miR-310-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_2649 | 0.69 | 8.71 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold4_30212 | 0.69 | 8.71 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_1146 | 0.57 | 3.61 | URS00004E6531_7227__dme-miR-5-5p | интрон, antisense | cluster2 | g1268 | aconitase |
| scaffold2_16253 | 0.56 | 5.28 | URS00000D9090_7227__dme-miR-929-5p | интрон | - | g6471 | complexin |
| scaffold1_7445 | 0.5 | 1.05 | URS00004F1775_7227__dme-miR-932-5p | интрон | - | g7445 | nuclear inhibitor of protein phosphatase 1 |
| scaffold3_21830 | 0.49 | 8.88 | - | 5'UTR | - | g11249 | chromodomain helicase DNA binding protei |
| scaffold3_21803 | 0.45 | 12.43 | URS0000003085_7227__dme-miR-279-3p | интрон | cluster4 | g11229 | HASPIN |
| scaffold31_34116 | 0.45 | 13.96 | URS00003DE3EC_7227__dme-miR-14-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold74_35167 | 0.41 | 6.64 | URS0000083675_7070_Tribolium_castaneum_(red_flour_beetle)_microRNA_tca-miR-2765-5p | интрон | - | g17661 | UNC-45 |
| scaffold3_21235 | 0.31 | 7.05 | URS000052DA91_7227__dme-miR-989-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_862 | 0.28 | 14.53 | URS000010CD08_7227__dme-miR-9c-5p | интрон | cluster6 | g1019 | serine/threonine-protein kinase |
| scaffold3_20801 | 0.28 | 4.26 | URS0000602386_7227__dme-miR-276a-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold28_33718 | 0.24 | 5.45 | URS000003A47B_7227__dme-miR-33-5p | интрон | - | g16974 | sterol regulatory element-binding protei n 1 |
| scaffold2_13581 | 0.21 | 2.01 | - | 3'UTR | - | g7795 | similar to ctl transporter |
| scaffold1_874 | 0.17 | 2.8 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_13173 | 0.16 | 9.48 | URS00002A1726_7227__dme-miR-998-3p | интрон | - | g7479 | cyclin-dependent kinase 2 |
| scaffold1_222 | 0.15 | 16.18 | URS0000025D76_7227__dme-miR-305-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_11049 | 0.14 | 13.46 | URS0000003085_7227__dme-miR-279-3p | интрон | - | g5570 | DNA polymerase alpha subunit B |
| scaffold15_32623 | 0.08 | 4.46 | - | интрон | - | g16370 | nuclear polyadenylated RNA-binding protein |
| scaffold3_23930 | 0.03 | 2.15 | URS000075B879_7460_Apis_mellifera_(honey_bee)_microRNA_ame-miR-3771 | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_10701 | 1.73 | - | межгенник | - | - | - | |
| scaffold2_12772 | -0.03 | 13.52 | URS00001EB94B_7227__dme-miR-283-5p | интрон | cluster7 | g7217 | thyroid receptor-interacting protein 11 |
| scaffold3_19450 | -0.04 | 1.14 | URS00005FE42D_7227__dme-miR-31a-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_19765 | -0.04 | 10.38 | - | интрон | cluster5 | g9692 | phosphatase 4 |
| scaffold2_18471 | -0.05 | 8.39 | URS00000163C0_7227__dme-miR-252-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_607 | -0.1 | 2.12 | - | интрон | - | g670 | collagen |
| scaffold1_5657 | -0.11 | 2.5 | URS0000209905_7227__dme-miR-125-5p | межгенник | cluster9 | - | - |
| scaffold3_20018 | -0.14 | 1.98 | URS000010CD08_7227__dme-miR-9c-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_4446 | -0.17 | 6.34 | URS000022A117_7227__dme-miR-190-5p | интрон | - | g4244 | talin |
| scaffold3_19763 | -0.19 | 10.05 | - | интрон | cluster5 | g9692 | phosphatase 4 |
| scaffold1_6 | -0.22 | 3.2 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_9284 | -0.22 | 14.71 | URS0000562752_7227__dme-miR-8-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_17919 | -0.33 | 0.71 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_18460 | -0.36 | 2.6 | URS000004B10C_7070_Tribolium_castaneum_(red_flour_beetle)_microRNA_tca-miR-2796-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_24910 | -0.37 | 5.83 | URS00002AADC9_7070_Tribolium_castaneum_(red_flour_beetle)_microRNA_tca-miR-3841-3p | межгенник | cluster8 | - | - |
| scaffold2_12775 | -0.38 | 8.7 | - | интрон | cluster7 | g7217 | thyroid receptor-interacting protein 11 |
| scaffold3_20081 | -0.44 | 11.5 | URS00000D51AF_7227__dme-miR-308-3p | интрон | - | g9961 | transcription factor E2f |
| scaffold3_22233 | -0.45 | 3.55 | - | интрон | - | g11593 | myc protein |
| scaffold1_5047 | -0.46 | 3.27 | URS00004252ED_7070_Tribolium_castaneum_(red_flour_beetle)_microRNA_tca-miR-1175-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_27468 | -0.59 | 4.2 | URS0000306AB9_7227__dme-miR-210-3p | 3'UTR, antisense | - | g12193 | TRP-phosphatase |
| scaffold3_25190 | -0.59 | 3.13 | URS000054656E_7227__dme-miR-314-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_20065 | -0.62 | 15.2 | URS000029C35A_7227__dme-miR-310-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_7849 | -0.65 | 7.77 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold2_16550 | -0.68 | 1.31 | - | ген, antisense | - | g6711 | putative helentron 5 helitron-like transposon replicase/helicase/endonuclease |
| scaffold1_3591 | -0.71 | 6.34 | URS0000110829_7227__dme-miR-988-3p | интрон | - | g3448 | pre-mRNA-processing-splicing factor 8 |
| scaffold1_2109 | -0.77 | 3.18 | URS0000484F8B_7227__dme-miR-375-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_25613 | -0.84 | 3.91 | - | интрон | - | g10494 | unknown |
| scaffold46_34760 | -0.84 | 0.99 | - | интрон | - | g17394 | mitogen-activated protein kinase 1 |
| scaffold1_7061 | -0.89 | 2.1 | - | интрон | - | g1712 | double-stranded RNA-binding protein |
| scaffold1_870 | -0.91 | 7.36 | URS000025E6EF_7227__dme-miR-79-5p | интрон | cluster6 | g1019 | serine/threonine-protein kinase |
| scaffold3_20529 | -0.91 | - | межгенник | - | - | - | |
| scaffold2_13994 | -0.93 | 1.37 | URS000016252E_7070_Tribolium_castaneum_(red_flour_beetle)_microRNA_tca-miR-11-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold4_28691 | -0.99 | 2.83 | URS00000A2528_7227__dme-miR-956-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_6509 | -1.02 | 2.63 | - | интрон | - | g1268 | aconitase |
| scaffold1_2758 | -1.02 | 2.07 | URS00004FD7F0_7227__dme-miR-263b-5p | 5'UTR | - | g2630 | unknown |
| scaffold1_3748 | -1.13 | 0.83 | URS000031F343_7227__dme-miR-927-5p | интрон | - | g3577 | mind-meld |
| scaffold3_24908 | -1.26 | 7.6 | URS00002AADC9_7070_Tribolium_castaneum_(red_flour_beetle)_microRNA_tca-miR-3841-3p | межгенник | cluster8 | - | - |
| scaffold3_24823 | -1.31 | 12.71 | - | интрон | - | g9826 | neural/ectodermal development factor |
| scaffold1_10119 | -1.33 | 11.79 | - | интрон | - | g4622 | ribosomal protein rps23 |
| scaffold3_20914 | -1.35 | 10.64 | URS0000490BC9_7227__dme-miR-315-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_26912 | -1.4 | 19.53 | URS00005DFDA7_7227__dme-miR-184-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_5663 | -1.47 | 9.94 | URS00002CFB5F_7227__dme-miR-100-5p | межгенник | cluster9 | - | - |
| scaffold2_15596 | -1.79 | 1.24 | - | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_5308 | -2.18 | 3.74 | - | интрон | - | g160 | unknown |
| scaffold1_5139 | -2.23 | 7.86 | URS00002FC254_7227__dme-miR-263a-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold1_5046 | -2.69 | 7.71 | URS00005942EF_7227__dme-miR-1-3p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_23296 | -2.87 | 0.72 | URS00001F2A5D_7227__dme-miR-1007-5p | 5'UTR | - | g12537 | d-amino acid oxidase |
| scaffold3_23298 | -2.87 | 0.72 | URS00001F2A5D_7227__dme-miR-1007-5p | межгенник | - | - | - |
| scaffold3_21982 | -3.15 | 1.39 | - | интрон | - | g11370 | serine-enriched protein |
| scaffold3_20975 | -4.16 | 1.93 | - | интрон | - | g10522 | unknown |
| scaffold19_32939 | -5.08 | 3.26 | - | интрон | - | g16607 | netrin |
Согласно таблице 3, среди микроРНК, расположенных на самой малой 4й хромосоме, наивысший процент новых микроРНК (то есть тех, которых, предположительно, нет у других насекомых и которые являются уникальными для комара P.vanderplanki). Превалируют те микроРНК, которые высоко и дифференциально экспрессируются между образцами. Причём если в общем микроРНК примерно равномерно распределены между хромосомами (см. Таблицу 1, строка "Плотость (шт/Mb)"), то когда мы смотрим на высокоэкспрессируемые и дифференциальноэкспрессируемые микроРНК, тут уже наблюдается явный перекос в сторону 4 хромосомы, более того на ней имеется кластер из