В первую очередь следует отметить, что при постоянных стрессовых условиях возможен рост с образованием псевдомицелия, представляющего главное изменение модели роста и клеточного цикла в целом. Клетки при этом удлиняются, почкование становится монополярным, и почки не отделяются от материнской клетки. В качестве стресс-фактора может выступить любой из тех, что формирует условия инкубирования дрожжевой популяции. Решающим здесь является интенсивность и продолжительность воздействия этого фактора на клетку.
Осмотическое давление определяется стремлением воды проникнуть через полупроницаемую мембрану в сторону более концентрированного раствора, из двух разделенных этой мембраной. Такое давление прямо пропорционально концентрации молекул, которые не могут пройти через мембрану. Цитоплазматическая мембрана дрожжевых клеток характеризуется полупроницаемостью в отношении воды и гидрофильных соединений с высокой молекулярной массой. Следовательно, когда в питательной среде низкая концентрация сухих веществ, то дрожжевые клетки испытывают гипоосмотический стресс и стремятся впитать воду, в более концентрированных средах, таких как сусло, у клеток наблюдается гиперосмотический стресс, что приводит к отдаче воды и сморщиванию цитоплазматической мембраны.
Учитывая эти обстоятельства, пиво является средой с очень небольшим осмотическим давлением, тогда как сусло имеет высокую концентрацию сухих веществ, и дрожжевая клетка при внесении ее в сусло испытывает больший или меньший осмотический стресс. Степень этого стресса зависит от плотности сусла, состава сахаров и физиологического состояния дрожжевой популяции. Растущие клетки гораздо более чувствительны к нему, чем клетки в стационарной фазе. Существует предположение, требующее доказательств, что это связано с присутствием трегалозы в стационарной фазе. Она, как и при термошоке, препятствует денатурации белков и для стабилизации содержимого клетки функционально взаимодействует с белками, возникающими в результате стресса. Как правило, гиперосмотический стресс приводит к сморщиванию клеток и перед началом роста им необходим некоторый адаптационный период. В это время существенно возрастает синтез глицерол-3-фофатдегидрогеназы, что приводит к существенному увеличению внутриклеточной концентрации глицерина, который и противодействует осмотическому давлению среды (HOG-путь). Глицерин может проникать через цитоплазматическую мембрану, и в отсутствие стресса мембранные поры этому не препятствуют. Гиперосмотический стресс вынуждает эти поры закрываться и, тем самым, снижается скорость выхода глицерина. Процесс брожения снижает осмотическую нагрузку на клетку, клетка преодолевает состояние стресса, и внутриклеточная концентрация глицерина снижается. Интересно и то обстоятельство, что сморщивание клетки происходит уже через минуту гиперосмотического воздействия, но может пройти несколько часов до момента регистрации существенного увеличения внутриклеточного содержания глицерина. Следует иметь ввиду, что у некоторых осмотолерантных дрожжей имеются активные системы потребления глицерина, которые не выявлены у Saccharomyces cerevisiae. Помимо описанного длительного срока адаптации, было высказано предположение, что дрожжи обладают хорошо развитой системой реагирования на осмотическое давление, которая регулируется ферментным механизмом замены Na+/H+, расположенным в предвакуолярных отделениях. Натриевый насос осуществляет активный транспорт ионов Na+ через мембрану, и при этом ионы Na+ поступают внутрь клетки. В результате ферментный механизм незамедлительно реагирует на сморщивание цитоплазмы путем передачи в нее Na+ из вакуоли с дальнейшей подачей в том же направлении воды, противодействуя, таким образом, ее отдаче во внешнюю среду.
При гипоосмотических условиях происходит переключение ферментных систем на синтез фосфокиназы С (ФКС-путь). Одним из результатов этого является стимуляция системы синтеза клеточной стенки, прочность которой увеличивается, и, следовательно, возрастает способность клетки физически противостоять поступлению в нее воды.
Одним из основных критериев технологической пригодности дрожжей для промышленного применения является их способность сохранять физиологическую активность при максимально высоких концентрациях образующегося этилового спирта. Этанол действует в той или иной степени токсично на все дрожжевые штаммы, но его эффективная ингибирующая концентрация варьирует в широких пределах. Кроме того, в метаболической стойкости дрожжей к этиловому спирту большое значение имеет состав питательной среды.
Токсическое воздействие на клетку этого соединения – есть результат увеличение проницаемости и пористости клеточной мембраны, что приводит к сбоям в транспортных системах и в поддержании межмембранного протонного градиента. Кроме того, пропорционально концентрации нарастает дефицит доступной цитоплазме воды.
В лабораторных условиях реакция клеток на воздействие этилового спирта проявляется в увеличении степени ненасыщенности имеющихся в цитоплазматической мембране жирных кислот, в росте содержания эргостерина, синтезе трегалозы и продуцировании специфических белков термошока.
В производственных условиях ситуация может быть совершенно другой. Во-первых, к тому времени, когда концентрация этилового спирта существенно возрастет, клетка наверняка будет не способна изменить состав липидов цитоплазматической мембраны, поскольку для такого изменения необходим молекулярный кислород, а при нормальном брожении он будет полностью утилизирован в течение первых часов после внесения дрожжей. Во-вторых, к тому времени, когда концентрация этилового спирта в бражке увеличится на столько, что включится реакция индукции, способность клеток синтезировать специфические белки термошока может быть существенно снижена из-за дефицита питательных веществ.
Установление механизмов устойчивости к этиловому спирту серьезно осложняется еще и тем, что выявлено более 250 генов, участвующих в этом процессе.
Микробиологическая токсичность двуокиси углерода известна давно. При концентрациях, эквивалентных давлению газа выше 0,2 атм., данное соединение стимулирует рост клеток. Хотя в сложных средах этот эффект выражен меньше, чем в простых, было высказано предположение, что при брожении пива при высокой скорости внесения дрожжей начало роса наблюдается раньше из-за более быстрого увеличения концентрации двуокиси углерода в свежем сусле. При давлении газа около 0,5 атм. цикл трикарбоновых кислот ингибируется, но спиртовое брожение продолжается вплоть до давления в 4,0 атм. Деление клеток прекращается при давлении около 2,5-3,0 атм. При этом клетки проходят через S-фазу, но не почкуются, и поэтому отличаются двойным составом ДНК и большим, чем обычно, размером.
На сегодняшний день нет единого мнения о биохимическом механизме действия двуокиси углерода. При этом, предполагается несколько вариантов:
- растворенная в воде двуокись углерода может действовать как конкурентоспособный ингибитор декарбоксилаз и уменьшать количество подвергающихся реакции декарбоксилирования соединений путем увеличения концентрации продукта;
- углекислота может вызвать общие нарушения в цитоплазматической мембране и изменения в составе жирных кислот;
- она может вступать в реакцию с аминогруппами белков с образованием карбаматов;
- в ходе исследований in vitro показано присутствие иона НСО3¯, который является анионным ферментным модификатором, вызывающим как активацию, так и ингибирование (в зависимости от фермента);
- двуокись углерода взаимодействует с заряженными группами в цитоплазматической мембране, изменяя их электрические и ионные свойства;
- недиссоциированная карбоновая кислота (Н2СО3) представляет собой полярную молекулу, которая может ассоциироваться с конечными группами на поверхности белков, изменяя их свойства.
Интересно, что при концентрациях углекислоты, позволяющих клеткам расти, отмечается явное влияние двуокиси углерода на формирование летучих ароматических соединений. Практическое использование такого влияния привело к появлению такого технологического приема как "ускоренное брожение" или "брожение под давлением". Суть его в том, что для ускорения спиртового брожения после первой фазы роста при лагерном брожении температуру увеличивают, и путем ограничения отвода газа повышается давление двуокиси углерода, что уменьшает образование летучих соединений. Таким приемом может регулироваться даже интенсивность образования соединений этой группы в зависимости от сорта пива. В этом важнейшим фактором является не давление, а концентрация двуокиси углерода в сбраживаемой среде. Эта концентрация зависит от температуры, скорости синтеза и скорости перехода из жидкой фазы. Известно, что газ выходит из раствора не без труда, и даже в случае, когда никаких ограничений нет, сбраживаемое сусло характеризуется некоторой степенью перенасыщения двуокисью углерода, эквивалентной избыточному давлению в 1,5 атм. Следовательно, при любых условиях необходимо иметь ввиду некоторое ее влияние на характеристики брожения и чрезвычайную чувствительность продуцирования летучих ароматических соединений к условиям брожения.
Большое количество исследований проведено относительно способности дрожжей противостоять окислительному стрессу. Установлено, что как субстрат кислород очень важен для биосинтеза ненасыщенных жирных кислот и эргостерина, необходимых для роста клеток. Кроме того, установлено, что на большинство генов кислород не влияет. В то же время, в аэробных условиях сильнее экспрессированы 140 генов, а в анаэробных – 219 генов. Только в аэробных или только в анаэробных условиях экпресситруются очень небольшое число генов.
При внесении в свежее сусло дрожжи подвергаются воздействию кислорода в его максимально возможной концентрации, что приводит в действие зависящую от концентрации экспрессию или подавление не подавленных глюкозой генов, деятельность которых регулируется кислородом. Вместе с тем, кислород метаболизируется дрожжами настолько быстро, что за несколько часов питательная среда его лишается, дрожжи переходят на анаэробный метаболизм, и модель генов должна приспосабливаться к этой новой окружающей среде, сохраняющейся в течение всего периода брожения. В первые несколько часов после засева дрожжи в своих попытках приспособиться к условиям высокой концентрации кислорода могут истратить энергию и материал, необходимые для осуществления обмена веществ. Это, в свою очередь, может повлиять на продолжительность лаг-фазы и интенсивность начального брожения.
Но в пивном брожении значение кислородного стресса не так велико, т.к. клетки подвергаются воздействию кислорода в течение короткого периода лишь в начале брожения. По этой причине в ходе реакций, протекающих в митохондриях, в клетки поступает очень небольшое количество активного кислорода, способного отрицательно повлиять на жизнедеятельность дрожжей.