Работа № 3. Собственная микрофлора и микрофлора загрязнения

Кожи рук

 

Цель: сделать посев микрофлоры кожи рук методом отпечатков на МПА

и на среду Эндо. Записать в тетрадь номер своего посева Посевы изучить на следующем занятии.

Дано: чашки со средами МПА, Эндо.

Теоретическая справка

Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды

Принципы проведения санитарно-микробиологических исследований

1. Правильный забор проб - а) с соблюдением стерильности; б) правил транс-
портировки, позволяющих избежать искажения результатов; в) быстрое
проведение исследований или сохранение материала до анализа в холо­-
дильнике (не дольше 6-8 часов).

2. Серийность проведения анализов. Для получения адекватных результатов
проводят забор серии проб из разных участков объекта. В лаборатории об-
разцы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество мате­
риала (среднее по отношению к материалу в целом).

3. Повторность отбора проб, позволяющую получить более достоверную ин­
формацию по загрязнению объекта.

4. Применение только стандартных унифицированных методов исследования
для получения сравнимых результатов.

5. Использование комплекса тестов.

6. Проведение оценки объектов по совокупности полученных результатов с
учетом других показателей - органолептических, химических, физических.

Методы проведения санитарно-микробиологических исследований пре­дусматривают определение общей микробной обсемененности (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов, выявление в исследуе­мых объектах патогенных микробов и их метаболитов.

ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы (СПМ), по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде.

Содержание СПМ определяют: 1) прямым подсчетом с помощью специаль­ных камер или электронным счетчиков, предварительно гомогенизируя пробу и внося краситель (эритрозин). Методика позволяет отличить живые от погибших бактерий; 2) посевом на питательные среды.

СПМ должны удовлетворять следующим характеристикам: а) постоянно оби­тать в естественных полостях человека и животных и выделяться в окружающую среду; б) не должны размножаться вне организма, исключая пищевые продукты; в) длительность их выживания в окружающей среде должна быть не меньше, и даже несколько больше, чем у патогенов; г) устойчивость СПМ в окружающей среде должна быть аналогичной или превышать таковую у патогенных микроорганизмов; д) у СПМ не должно быть в окружающей среде «двойников»; е) микроб не должен изменяться в окружающей среде; ж) методы индикации и идентификации СПМ должны быть простыми.

Микрофлора воздуха

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному числу - количеству особей, обнаруживаемых в 1 м³ воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий - представителей микрофло­ры дыхательных путей - гемолитические стрептококки, золотистый стафилококк.

Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает опре­деление микробного числа и санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП), а также патогенных возбудителей.

Нормативы: чистый воздух зимой: ОМЧ не более 4500, гемолитических стрептококков - до 35;

грязный воздух зимой: ОМЧ более 7000, гемолитических стрептококков – до 124.

Нормативные показатели микробной обсемененности воздуха в помеще­ниях больницы

Операционные	ОМЧ	Золотистый стафилококк (в 250 л)
до начала работы	не более 500	не допускается
во время работы	не более 1000	не допускается
родильные комнаты	не более 1000	не допускается
палаты для недоношенны> детей	не более 750	не допускается

Седиментационный метод (по Коху) - оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определенное время (5-10 минут на общую обсемененность и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, надписывают и выдерживают в термостате 24 часа и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха: по приблизительному подсчету на площадь 100 см² в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

 

Аспирационный метод (метод Кротова) - более точный количественный метод оп­ределения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью прибора.

Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексиглазовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благода­ря постоянному вращению чашки под входной щелью.

 

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

х= ^{а х 1000}

^V

х – количество микробов в м³ воздуха;

а - количество выросших на чашке колоний;

V - объем пропущенного через прибор воздуха, дм³ ;

1000 - искомый объем воздуха, дм³.

 

Оценка санитарно-бактериологического состояния воздуха по общему микробному числу на МПА методом Коха проводится по формуле Омелянского:

 

х= ^{а х 100 х 5 х 1000}

^{В х 10 х Т}

х – количество микробов в м³ воздуха;

а – количество колоний в чашке;

Т – время экспозиции, мин;

В – площадь чашки Петри в см² (78.5 см²);

100 – площадь (см²), на которую происходило оседание микробов;

1000 – искомый объем воздуха в литрах;

5 – время по расчету Омелянского, мин;

10 – объем воздуха (л), из которого происходило оседание микробов.

 

 

Микрофлора воды

Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1) микроб­ному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру - наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды. Кроме того, в воде определяют наличие энтерококков, сальмонелл, энтеровирусов. Согласно ГОСТу на питьевую водопроводную воду, ее коли-титр должен быть не менее 300 мл, коли-индекс - не более 3, общее микробное число - не более 100.

Нормативы: ОМЧ не более 100, коли-титр - 333 мл, коли-индекс не более 3.

 

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 500 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП.

Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства

Pseudomonadасеае и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде.

Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не

перево­рачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной

диметил-пфенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Микрофлора почвы

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарно-показательных бакте­рий, расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека или животных. Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указы­вает на свежее, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численно­сти сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1г почвы.

Нормативы: чистая почва: коли-титр - 1 и выше; перфрингенс-титр - 0,01 и выше; ОМЧ- 100-1000.

Загрязненная почва: коли-титр - 0,9 - 0,01; перфрингенс-титр - 0,009-0,0001; ОМЧ-1000-100000.

Сильно загрязненная почва: коли-титр - 0,009 и ниже; перфрингенс-титр -0,00009 и ниже; ОМЧ - 10000-4000000.

Ход исследования. ОМЧ. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным но­жом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10"³, 10"⁴, 10"⁵. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45°С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра.

Различные разведения почвен­ной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера ( 1л дистиллиро­ванной воды, 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 10 г лактозы; рН 7,4-7,6; 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового). Разливают в пробирки с поплавка­ми. Инкубируют при 43°С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках Гр- палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная (изменение окраски на синий цвет) проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появле­ние в среде кислоты и газа подтверждает наличие Е. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной сус­пензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. Инкубация при 43°С 48 часов. Учитывают результаты по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (Гр+ крупные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почерне­нию и разрыву среды впервые 12 часов роста при 43⁰ С).