При иммобилизации глюкозооксидазы на одной стороне мембраны с небольшим размером пор и ее размещении поверх рабочего платинового электрода система начинает функционировать как биосенсор глюкозы. Диффузия глюкозы через наружную мембрану к слою фермента приводит к образованию потока перекиси водорода к поверхности электрода. Ее количество оценивается по увеличению тока электрода.
Прямое определение глюкозы биосенсором с участием глюкозооксидазы протекает по следующим химическим реакциям:
Образование перекиси водорода может быть зарегистрировано амперометрическим методом с основным платиновым электродом и Ag/AgCl — электродом сравнения. Ток, образующийся в процессе измерения, пропорционален активности глюкозы образца.
Из-за влияния различных факторов глюкозооксидазная сенсорная система имеет ряд ограничений:
1. Ответ биосенсора во многом зависит от интенсивности перемешивания образца. При недостаточном перемешивании возможно искажение ответа, поскольку потребление субстрата ферментом ведет к прогрессирующему истощению его количества вблизи мембранной поверхности.
2. Свойства иммобилизированного фермента делают систему высокочувствительной к изменениям рН образца, температуры и напряжения кислорода, являющегося субстратом реакции.
3. Адсорбция белка и клеток крови на мембране может привести к быстрой потере ответа сенсора на глюкозу, особенно при использовании образцов цельной крови.
Методы «сухой химии».
Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традиционным лабораторным методам исследований. Со временем удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Для примера можно рассмотреть глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».
|
|
Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.
|
| Конструкция тест-полоски. |
Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски. Мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.
|
|
Приборы для измерения глюкозы в цельной крови откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16–ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.
Недостатки глюкозооксидазного метода.
Второй этап глюкозооксидазной реакции, включающий пероксидазную реакцию является менее специфичным и более капризным по сравнению с самой глюкозооксидазной реакцией. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.
|
|
Глюкозооксидазный метод пригоден для определения глюкозы в спинномозговой жидкости. В моче же содержатся высокие концентрации веществ, способных вмешиваться в пероксидазную реакцию, в частности, мочевая кислота, что способствует получению ложноотрицательных результатов. В связи с этим глюкозооксидазный метод следует с осторожностью использовать для определения глюкозы в моче.
Гексокиназный метод
Гексокиназный метод основан на двух последовательных ферментативных реакций: Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволяет его широко рекомендовать для широкого спектра клиник. По данным Коллегии американских патологов (САР), в 2001 г. гексокиназный метод использовали в более чем половине всех лабораторий США. Данный метод рассматривают в качестве референтного. В этом случае белки сыворотки или плазмы крови осаждают растворами гидроксида бария Ba(ОН)2 и сернокислого цинка (ZnSO4) а надосадочную жидкость используют для проведения определения глюкозы. Надосадочную жидкость смешивают с рабочим реактивом, содержащим АТФ, НАД, гексокиназу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. После окончания реакции определяют величину поглощения при длине волны 340 нм.
