Ферментные датчики мембранного типа.

На первом этапе происходит окисление глюкозы до глюконовой кислоты при участии фермента глюкозооксидазы. Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода.

На втором этапе молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О₂^-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена (реакция Триндера)

Наиболее распространеный способ регистрации глюкозооксидазной реакции фотометрический биохимический метод.

На рис. 1 показан спектр рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Рисунок 1. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза).

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением биохимических фотометров, так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови пациента.

Использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода.

Измерение концентрации глюкозы из цельной крови можно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Это свойство перекиси используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

Способы регистрации глюкозооксидазной реакции глюкозооксидазной реакции в лабораторной практике (схема).

Ферментные датчики мембранного типа.

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 2). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, иммобилизированной на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н₂О₂. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

Рисунок 2. Измерительная ячейка.

В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия).