Лекция 4. Тема: Краткая история развития биотехнологии и периоды развития биотехнологии. Характеристика. Биотехнология лекарственных средств. (2 часа)
План лекции
1. Краткая история развития биотехнологии и периоды развития биотехнологии.
2. Биотехнология лекарственных средств.
Историю развития биотехнологии - возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический. Эмпирический (от греч. empeirikos — опытный) или доисторический период — самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет — до нашей эры и около 2000 лет — нашей эры. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к разряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяйства) стал побудительным мотивом революции в изготовлении продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад и привела к изобретению техники земледелия — началу производительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века.) Стали формироваться так называемые приречные цивилизации Месопотамии, Египта, Индии и Китая. Шумеры — первые жители Месо-потамии (на территории современного Ирака) создали цветущую в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством готовить пиво. В этом следовали им ассирийцы и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издревле приготавливавшийся в домашних условиях, хотя о микробах — индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам Пастера, и это несмотря на существование с XIV в. так называемого "Орлеанского способа" приготовления уксуса; первая дистилляция вина осуществлена в XII в.; водку из хлебных злаков получили в XVI в.; шампанское известно с ХVШ в., но получение почти абсолютного этанола впервые удалось в ХIV в. испанцу Раймунду Луллию (ок. 1235 — 1315) благодаря перегонке вина с негашеной известью.
В те древние времена продукты питания растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии (8 — 7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая более 30 000 клинописных табличек, из которых в 33 имелись сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом городе размещался сад лекарственных растений. К тому же эмпирическому периоду относятся: получение кисломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.
Длительное накопление фактов происходило и в области микологии (от греч. myKes — гриб). Сведения о грибах можно найти в источниках древности, а Луции Лициний Лукулл (106 — 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами ("лукуллов пир"), прсдпочитал всем сьедобным грибам кесарев гриб (Amanita cesarea, L.). Древние евреи хорошо знали ржавчину хлебных злаков и головню. В (V — I веках до н. э. были собраны интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах Аристотеля, Диоскорида, Плииия Младшего, Теофраста. В последующие века нашей эры микология стала самостоятельной наукой — велика роль в этом Д. Персоона и Э. М. Фриза, по праву считающихся отцами систематической микологии.
Таким образом, народы исстари пользовались на практике микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных.
Второй, этиологический (от греч. aitia — причина) период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и первую треть XX века (1856 — 1933 гт.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 — 1895) — основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической, санитарной). С аналитической микробиологией непосредственно связано открытие Пастером молекулярной ассиметрии (стереоизомерии). Это, по существу, бриллиантовыи век микробиологии. Пастер вскрыл микробную природу брожений, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, экспериментально опроверг ходячее тогда представление о самопроизвольном зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации, называемый по его имени пастеризацией и т. д.
Немеркнущая слава Пастера не затмила имен его выдающихся учеников и сотрудников: Э. Дюкло, Э. Ру, Ш. Э. Шамберлана, Ж. А. Вильемена, И. И. Мечникова. В этот же период творили Р. Кох, Д. Листер, Ш. Китазато, Г. Т. Риккетс, Д. И. Ивановский, А. Лаверан и другие.
Параллельно с Пастером трудился в Германии, а позднее — во Франции, выдающийся миколог А де Бари (1831 — 1888) — основоположник физиологической микологии. Изучив стадии размножения и историю индивидуального развития грибов (онтоге-нетический метод), с учетом их взаимоотношений с другими видами, а также цитологических и биологических особенностей, де Бари создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе современных классификационных схем микро и макромицетов.
Де Бари — основоположник микофитопатологии — науки о грибных болезнях растений (от греч. filon — растение, palhos — болезнь), под его руководством сформировалась плеяда выдающихся ученых (в том числе — из России): Ф. М Бальфур, И. В. Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М. С. Воронин, А Кох, А. С. Фаминицин и др.
В биотехнологии важными являются питательные среды для культивирования ряда биообъектов. Пастер приготовил первую жидкую питательную среду в 1859 году, метод выращивания грибов на желатине предложил О. Брефельдв 1864 г. Ж. Ролен сообщил о жидких средах для выращивания нитчатых грибов в 1870 г Р. Коху в 1876 г. удалось вырастать бациллы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох предложил метод культи-вирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и затем — на агаризованных питательных средах.
В настоящее время, предлагая самые сложные и необычные в каком-либо отношении среды для выращивания биообъектов, мы опираемся на основополагающие результаты этих выдающихся ученых. Аналогичным образом можно сказать и о вариантах способов стерилизации питательных сред, имея в виду тиндализацию, кипячение, дробную стерилизацию и др. Все они основывались на необходимости уничтожения посторонней микрофлоры, которая попадала в среды в процессе их изготовления.
В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в 1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д. И. Ивановским (1864 — 1920). Последовавшие за этим обнаружения других вирусов обеспечили становление новой научной дисциплины — вирусологии.
Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответсгвующих процес-сов (бродильных, окислительных и др.). Например, маслянокислые бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобак-терии и молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этанола до уксусной кислоты и т.д. В этот период было начато изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также некоторых продуктов обмена (метаболизма) — ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот,- во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.
Знание причин биологических процессов еще не исключало нестерилъные операции, хотя и стремились к использованию чистых культур микроорганизмов.
Для всестороннего изучения морфолого-физиологических свойств и продуктов обмена, прежде всего, микробов все ранее предложенные способы их выращивания оказались малопригодными. Более того, накопление однородной по возрасту большой массы клеток оставалось исключительно трудоемким процессом. Вот почему требовался принципиально иной подход для решения многих задач в области биотехнологии. В 1933 году А Клюйвер и Л. X. Ц. Перкин опубликовали работу "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. С этого времени начинается третий период в развитии биологи-ческой технологии — биотехнический. Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечившего проведение процёссов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939 — 1945 rr.f когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфициро-ванными ранами). Все прогрессивное в области биологических и технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в биотехнологии. Сдедует отметить, что уже в 1869 г.. Ф. Мишер получил "нуклеин" (ДНК) из гнойных телец (лейкоци-тов); В. Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию ферментов; Т. Леб в 1897 г. установил способность к выживанию организма (в пробирках с плазмой или сывороткой крови) клеток крови и соединительной ткани; Г. Хаберланд в 1902 г. показал возможность кулътивирования клеток различных тканей растений в простых питательных растворах; Ц. Нейберг В 1912 г. раскрыл механизм процессов брожения; Л Михаэлис и М. Л. Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных рсакций, а А. Каррел усовершенствовал способ выращивания клеток тканей животных и человека и впервые применил экстракт эмбрионов для ускорения их роста; Г. А. Надсон и Г. С. Филлипов в 1925 г. доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на дрожжи, а в 1937 г. Г. Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот (ЦТК); в 1960 г. Ж. Барски и др. впервые обнаружили соматические гибриды опухолевых клеток мыши. Следовательно, накопленные научные факты стали побудительным мотивом для разработки способов крупномасштабного культивирования клеток различного происхождения. Это, необходимо было для облучения различных клеточных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда аминокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция) разработал теоретические основы непрерывного управляемого культивирования микробов; в 50-е годы вопросам практической реализации непрерывного культивирования микроорганизмов посвятили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек, Н. Д. Иерусалимский и др.
Примерно за 40 дет третьего периода были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том числе главного из них — биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее время.
Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от греч. genesis — происхождение, возникновение, рождение) начался с 1972 г. В этом году П. Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с колдегами выделил в химически чистом виде лактозный ген из кишечной палочки, показав тем самым возможность направленных манипуляций с генетическим материалом бактерий.
Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозможным достигнуть современных результатов в области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНКГ выделение и изучение специфичных ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнологических процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть генотехнического периода.
Лекция 5. Тема: Биомедицинские технологии. Определение. Характеристика. Препараты биогенных стимуляторов. Характеристика. Классификация. Технологические схемы производств (2 часа)
План лекции
1. Биомедицинские технологии, определение, характеристика.
2. Препараты биогенных стимуляторов, их характеристика и классификация.
3. Технологические схемы производств
В сфере производства лекарственных средств она вытесняет традиционные технологии, открывает принципиально новые возможности. Биотехнологическим способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы.
В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в медицине – разработка медицинских биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.
До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического действия иногда был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. И эти ожидания оправдались.
На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые в принципе могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека. Впрочем, хотя более 30 таких биотехнологических препаратов и получило одобрение в США, пройдет еще несколько лет, прежде чем они будут рекомендованы для широкого использования и поступят в продажу; вначале их подвергнут проверке на животных и проведут тщательные клинические испытания. Однако фармацевтические фирмы уже сейчас проявляют к ним интерес. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12—14% в год и к 2007 г. составит примерно 20 млрд. долларов.
Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профилактические меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител; их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» — чужеродный агент, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку-мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.
Препараты биогенных стимуляторов. Характеристика. Классификация. Технологические схемы производств.
Биогенные стимуляторы, будучи введены в «большой» организм (путем пересадок консервированных тканей или инъекций экстрактов), активизируют в нем жизненные процессы. Усиливая обмен веществ, они повышают физиологические функции организма, в случае болезни – повышают его сопротивляемость и регенеративные свойства, способствуют выздоровлению.
Химическая природа биогенных стимуляторов до настоящего времени до конца не изучена. Установлено, что при биостимуляции происходит глубокие биохимические изменения.
Процессы образования и накопления биогенных стимуляторов в тканях в результате понижения температуры тщательно изучены А. В. Благовещенским. Автор считает, что при этом нарушаются окислительные и гидролитические процессы, происходит накопление сложной смеси аминокислот и продуктов их дезаминирования. Благодаря окислительному дезаминированию в процессе консервирования тканей из аспарагиновой кислоты образуются яблочная, фумаровая и янтарная кислоты; из фенилаланина — коричная; из тирозина — параоксикумаровая и ряд других кислот. Указанные вещества в случае восстановления нормальных условий для жизнедеятельности клеток или при выделении в другой организм могут соединяться с инертными белками и способствовать их активации. Возможно, что дикарбоновые кислоты, входящие в состав биогенных стимуляторов, соединяясь своими карбоксильными группами со свободными аминными группами белковой молекулы, вызывают в последней деформацию в силовых полях, связанную с образованием новых энергетических уровней. Тем самым повышается способность ферментов к трансформации энергии. Повышение качества ферментов, считает А. В. Благовещенский, как бы омолаживает весь организм. Накопление органических кислот (ацидоз тканей) яблочной, янтарной может образовываться вследствие дезаминирования аспарагиновой кислоты. Превращение яблочной кислоты, благодаря ее дегидрированию и восстановлению фумаровой кислоты, приводит к накоплению янтарной кислоты. Непредельные кислоты ароматического ряда — коричная и оксикоричная — могут образовываться из тирозина и фенилаланина в результате гидролиза гликозидов, содержащих эти кислоты.
В консервированных на холоду листьях алоэ А. Ф. Сысоевым также обнаружены разнообразные органические кислоты: лимонная, яблочная, янтарная, рибонуклеиновая, аргинин. Эти кислоты и их натриевые и калиевые соли в определенных концентрациях оказывают стимулирующее действие на рост дрожжевых клеток, повышают дегидразную активность гранулирующих тканей и регенерирующей печени.
Количество лимонной кислоты в очитках некоторых растений увеличивается более чем в два раза в процессе биостимуляции. Биологическая активность натриевой и калиевой солей лимонной яблочной и янтарной кислот определенных концентраций оказывают стимулирующее действие на рост дрожжевых клеток, повышают дигидразную активность гранулирующих тканей регенерирующей печени.
Имеющиеся к настоящему времени сведения о химическом свойстве препаратов (по В. П. Филатову) показывают, что различные по своему происхождению вещества могут являться общими компонентами для всех препаратов этой группы — органические кислоты, полисахариды; вместе с тем есть и сугубо индивидуальные вещества. Так, летучие амины обнаруживаются в торфе и пелоидодистилляте в отличие от препаратов алоэ, а стероидные гормоны находятся лишь в препаратах плаценты.
Обобщение результатов целого ряда работ, посвященных выяснению химического состава, дает возможность сделать некоторые выводы. Биогенные стимуляторы не являются одним каким-либо специфическим веществом, образующимся при биостимулировании тканей. По мнению ряда исследователей, одна из основных ролей в биологической активности консервированных тканей принадлежит органическим карбоновым кислотам, представленным в виде смеси кислот в их естественном соотношении. Соотношения органических кислот могут быть различными, в зависимости от специфики обмена веществ в той или иной ткани. В период стимулирования тканей, помимо карбоновых кислот, накапливаются продукты промежуточного обмена; весьма вероятно, что их присутствие может усиливать биологическую активность карбоновых кислот и таким образом дополнять комплекс активных веществ. Считается, что лечебный эффект тканевой терапии можно отнести за счет специфического действия присутствующих в тканевых препаратах рибонуклеиновой, травматиновой аминокислот, а также азотсодержащих веществ, углеводов, липидов.
Тканевые препараты, повышая неспецифическую резистентность организма, в отличие от других препаратов подобного действия, не обладают кумулятивными и анафилактическими свойствами, не вызывают привыкания и усиливают антитоксическую функцию печени. Практическая безвредность тканевых препаратов подтверждается также отсутствием тератогенных, эмбриотоксических и канцерогенных проявлений. Ассортимент препаратов биогенных стимуляторов разнообразен, их получают из тканей как растительного, так и животного происхождения.
Препараты биогенных стимуляторов растительного происхождения.
Экстракт алоэ жидкий (Extractum Aloe fluidum) – получают из биостимулированных листьев алоэ древовидного (Aloe arborescens). Представляет собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета. Применяется внутрь при язвенных болезнях желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхитах и других заболеваниях.
Линимент алоэ (Linimentum Aloes). Состав: сока алоэ древовидного (консервированного из биостимулированных листьев) — 78 частей; масла касторового — 10,1 части; эмульгатора — 10,1 части; масла эвкалиптового — 0,1 часть; кислоты сорбиновой — 0,2 части; натрий-карбоксиметилцеллюлозы — 1,5 части. Однородная густая масса белого или светло-кремового цвета с характерным запахом.
Применяют наружно при ожогах, для лечения пораженной кожи при лучевой терапии.
Выпускают по 30—50 г во флаконах оранжевого стекла. Хранят в защищенном от света месте при температуре до +10 °С.
Сок алоэ (Succus Aloes). Готовят из свежесобранных листьев (или деток). Состав: сока алоэ — 80 мл; спирта этилового 95% — 20 мл; хлоробутанолгидрата — 0,5%.
Слегка мутная жидкость светло-оранжевого цвета, горькая на вкус. Под влиянием света и воздуха темнеет.
Применяют наружно в виде примочек или орошений при лечении гнойных ран, ожогов, воспалительных заболеваний кожи. Внутрь назначают при гастритах, энтероколитах, запорах.
Выпускают во флаконах по 100 мл. Хранят в прохладном, защищенном от света месте.
Биосед (Biosedum). Водный экстракт из биостимулированной (по В. П. Филатову) свежей травы очитка большого (Sedum maximum (L) Sutes). Определенное количество лекарственного сырья измельчают на пастообразователе «Волтарь-5». Сок отжимают с помощью серийного пресса ВПРД-5. Отжатое от сока сырье (жом) экстрагируют водой (1:10) при температуре 95—98 °С в течение 15 мин, повторяя операцию 4 раза. Сок и извлечения объединяют, отстаивают, фильтруют. Полученный препарат — прозрачная жидкость, светло-желтого цвета со слабым своеобразным запахом, рН 5,0—6,5. Разливают ампулы по 1 мл, стерилизуют при температуре 110°С 30 мин. Получают препарат и в виде сухого сока, тогда для сушки применяют распылительную сушилку РСЛ-10.
Химический состав: около 17 веществ флавоноидной природы, фенолкарбоновые кислоты, кумарины.
Применяют как вспомогательное средство для стимуляции обменных и регенеративных процессов в офтальмологической, стоматологической, хирургической и терапевтической практике (при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки). B стоматологической практике (при пародонтозе) применяют в виде аппликаций, электрофореза, инъекций в ткани десен.
Выпускают в ампулах по 1 мл, в упаковке по 10 шт. Хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре.