Е.С. Шигина
аспирант
Вологодская ГМХА,
В.Н. Самотокина
магистрант 2 курса ф-та
технологии молока,
Вологодская ГМХА,
научн. рук. И.С. Полянская
poljanska69@mail.ru
к.т.н., доц.,
Вологодская ГМХА,
г. Вологда
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
Аннотация: в публикации рассматриваются методы микробиологического контроля молока молочных продуктов, как стандартные, так и инновационные, а также методы анализа эффективности пробиотических культур, включаемых в молочные продукты и методы селекции эффективных пробиотиков
Ключевые слова: патогенные и условно-патогенные микроорганизмы ПиУПМ, бактерии группы кишечной палочки БГГП, полимеразная цепная реакция ПЦР, селекция
Микробиологические методы исследования молочного сырья и продуктов можно разделить на методы микробиологического (бактериального) контроля технически вредных, ПиУПМ и методы селекции и контроля производственно-ценных, в частности, пробиотических заквасочных культур.
Остаются арбитражными для новых методов бактериального контроля рутинные методы, основанные на подсчёте колоний на плотных питательных средах. Так, в международных стандартах ИСО 8553, ИСО 13559, ИСО 11966, ИСО 6785, ИСО 8870, ИСО 11059, ИСО 2296, ИСО 6730, ИСО 27265, ИСО 6611 [1-10] используются чашки Петри или агаровые пластинки со специальными питательными средами.
Являющиеся стандартными в России методы бактериального контроля молочных продуктов, как на плотных, так и на жидких питательных средах, с использованием тех же принципов разведений, стандартной аликвоты или обогащения пробы собраны в Методических рекомендациях МУ [11].
Продолжительность анализа методов составляет сутки и более. Основной движущей силой развития этих является необходимость быстрого выявления ПиУПМ.
Несмотря на то, что идеальный экспресс-метод микробиологического контроля, обеспечивающий определение конкретного микроорганизма в реальный момент времени ещё не разработан [12], существующие ускоренные микробиологические методы существенно облегчают текущий микробиологический контроль.
Быстро оценивать общее микробное число, а также БГКП, количество дрожжей и плесеней и др., позволяют методы измерения биохимической активности (аденозинтрифосфата, ферментов), с использование проточных цитомеров, сеточного мембранного фильтра вместо агара, а также автоматизированных систем подсчёта.
Устройство современных проточных цитометров (сортеров) настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации [13]. Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Полученные данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или плотностных графиков. Подготовка суспензии и её обработка осуществляются в течение 1-1,5 часов. Однако проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходным материалом [13].
Для ускоренного подсчёта бактерий также используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени [14]. Системы ПЦР позиционируются на рынке, как полуавтоматические системы, в которых обогащённые пробы подвергаются лизису, затем погружаются в термоциклер, который подключён к персональному компьютеру и регистрирует флуоресценцию после каждого специфического связывания с целевой ДНК. Полная продолжительность ПЦР может составлять всего лишь 20 мин, однако недёшевы расходные материалы, т.к. требуются патентованные обогатительные среды и смолы для экстракции ДНК [15, 16].
Система идентификации микроорганизмов МикроТакс является автоматизированной системой для экспрессного определения микроорганизмов и их чувствительности к антибиотикам, основанной на различных типах диагностических планшет. Принцип действия: фотометрическая регистрация результатов биохимических реакций с последующей компьютерной обработкой данных [18].
Импедансный (от лат. impedio – препятствую) метод - один из новых способов экпресс-исследования общего микробного числа или конкретных микроорганизмов основанный на исследовании двойного электрического слоя на твердых электродах [19]. Модель экспресс-анализатора БакТрак 4300, автоматически регистрирует рост широкого спектра микроорганизмов, в том числе ББКП в течение одного часа.
| 
|
| Рис. 1. МикроТакс, Швейцария, фотометрический электронный метод [18] | Рис. 2. Прибор «БакТрак», Австрия, работающий по импедантсному методу [19] |
Существуют также методы проверки качества предлагаемых рынком продуктов с пробиотиками, методы селекции эффективных пробиотиков. К стандартам, регламентирующим использование данных методов, относятся: ИСО 17992, ИСО 27205, ИСО 26323, ИСО 29981, ИСО 20128, ИСО 7889, ИСО 9232 и др. [20-26, 11, 27-34].
Поиск или получение новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, т.е. селекция включает [35, 36]:
1. Селекцию посредством естественного отбора практически ценных форм.
2. Применение искусственного мутагенеза, усиливающего появление различных мутаций.
3. Методы рекомбинации между близкородственными культурами (конъюгация, трансформация, трансдукция).
4. Использование генной нженерии и маркеров (плазмид-векторов, и др.) широкого круга хозяев.
Ориентировочное определение групповой и видовой принадлежности пробиотика, полученного селекцией, проводят также исходя из набора признаков: окраска по Грамму; реакция Фрогес-Просгауэра; способность сбраживать различные сахара и другим биохимическим тестам [36].
Окончательную идентификацию проводят в специализированных лабораториях, в том числе с помощью ПЦР-диагностики.
Антагонистическую активность пробиотиков в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов ПиУПМ определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов [36].
В случае штамма транзиторного пробиотика, действие которого ограничивается временем пробиотикотерапии, и представляет собой метаболический эффект (антимикробных веществ, в т. ч. бактериоцинов, органических кислот, в т. ч. короткоцепочечных жирных кислот, экзополисахаридов) штаммы могут быть охарактеризованы на способность к их продукции.
У потенциальных пробиотических штаммов должны быть выявлены хорошие технологические характеристики: они должны сохранять жизнеспособность, генетическую стабильность, функциональные пробиотические характеристики на всех этапах производства, транспортировки и хранения, не вызывать в продукте недопустимых вкусов и запахов [36].
ХХI век был назван на международном тематическом симпозиуме этой пробиотиков. Разработка усовершенствованных методов микробиологических исследований – одна из актуальных проблем пищевой биотехнологии вообще, и связанной с использованием пробиотиков, в частности.
Литература и примечания:
[1] ИСО 8553 Метод подсчета микроорганизмов в сыром молоке / Молоко и молочные продукты. Энциклопедия международных стандартов / О.Н.Фомина. – М.: Протектор. – 880 с.
[2] ИСО 13559 Метод определения количества посторонних микроорганизмов сливочном масле, в кефире и в свежем сыре / там же.
[3] ИСО 11966 Метод определения наиболее вероятного числа Е.coli / там же.
[4] ИСО 6785 Метод определения сальмонеллы в молоке и молочных продуктах / /там же.
[5] ИСО 8870 Метод определения термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками в молоке и молочных продуктах / там же.
[6] ИСО 11059 Метод подсчёта псевдомонад в молоке и молочных продуктах / там же.
[7] ИСО 22964 Метод обнаружения E.sahazakii в порошковом молоке и порошковых продуктах детского питания / там же.
[8] ИСО 6730 Метод подсчёта колониеобразующих единиц (КОЕ) психотрофных микроорганизмов в сыром и пастеризованном молоке / там же.
[9] ИСО 27265 Метод подсчёта колониеобразующих единиц термоустойчивых спор в сухих молочных продуктах / там же.
[10] ИСО 27265 Метод обнаружения и подсчёта колониеобразующих единиц жизнеспособных дрожжей и/или плесеней в молоке и молочных продуктах / там же.
[11] МУ Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности.
[12] Fung D. Y. C., Predictions for rapid methods and automation in food microbiology // J. of AOAC Intern. – 2002. – 85. – P. 1000.
[13] Хайдуков С.В. Проточная цитометрия как современный метод анализа [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http:/https://www.mimmun.ru/mimmun/article/viewFile/176/178
[14] Ibekwe A. M., Watt P. M., Grieve C. M., Sharma V. K., Lyons S. R., Multiplex fluorogenic real-time PCR for detiction and quanification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands // Applied and Environmental Microbiology. – 2002. – 68. – P. 4853-4862.
[15] Rijpens N. P., Herman Lieve M. F. Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathohens // J. of AOAC International. – 2002. – 85. – P. 984-995.
[16] Методы анализа пищевых продуктов. Определение компонентов и пищевых добавок. Элтеш С (ред.-сост.) – пер. с англ. СПБ.: Профессия, - 2016. – 564 с.
[18] Микробиологический анализатор МикроТакс [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.каталог-нп.рф/pribor/18336
[19] Микробиологический анализатор БакТрак, [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.sy-lab.ru/produktsiya/mikrobiologiya/mikrobiologicheskie-analizatory/
[20] ИСО 17992 / Молоко и молочные продукты. Энциклопедия международных стандартов / О.Н.Фомина. – М.: Протектор. – 880 с.
[21] ИСО 27205 Требования в промышленным бактериальным заквасочным культурам / там же.
[22] ИСО 26323 Метод определения кислотообразующей активности молочнокислых микроорганизмов / там же.
[23] ИСО 29981 Метод селективного подсчёта бифидобактерий в молочных продуктах / там же.
[24] ИСО 20128 Метод подсчёта Lbs. acidophilus в молочных продуктах/ там же.
[25] ИСО 7889 Метод подсчёта колоний микроорганизмов йогурта / там же.
[26] ИСО 9232 Метод идентификации микроорганизмов в йогурте не основании их морфологических, культуральных и физиологических свойств / там же.
[27] ГОСТ ISO 29981-2013 Продукты молочные. Подсчет презумптивных бифидобактерий.
[28] ГОСТ ISO 27205-2013 Продукты кисломолочные. Бактериальные заквасочные культуры. Стандарт идентичности
[29] ГОСТ 1044411-2013. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества мезофильных молочнокислых микроорганизмов
[30] ГОСТ 32901-2014 Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа (с Поправками)
[31] ГОСТ 32923-2014 Продукты кисломолочные, обогащенные пробиотическими микроорганизмами. Технические условия
[32] ГОСТ 33491-2015: Продукты кисломолочные, обогащенные бифидобактериями бифидум. Технические условия
[33] ГОСТ 33951-2016. Молоко и молочная продукция. Методы определения молочнокислых микроорганизмов
[34]МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2. по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и фукнционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. Г.Г. Онищенко. - 2011 г.
[35] Полянская И.С., Тераевич А.С., Новокшанова А.Л., Забегалова Г.Н. Нутрициологические, микробиологические, генетические и биохимические основы разработки и производства продуктов с пробиотиками. Вологда-Молочное. ИЦ ВГМХА. - 2013. - 200 с.
[36] Тераевич А.С., Полянская И.С., Корюкина М.В. Эффективные пробиотики в животноводстве. Подбор, получение и применение / Saarbrucken. - 2016. – 128 с.
@ Е.С. Шигина, В.Н.Самотокина, 2018