Материал для выделения вируса и выявления антигена получают путем биопсии или после смерти из папул на коже, поражений на легких или лимфатических узлов. Образцы для
выделения вируса и выявления антигена с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) собирают в течение первой недели с момента появления клинических признаков, до начала выработки нейтрализующих антител. Образцы для выявления генома путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) собирают до и после выработки нейтрализующих антител. Лейкоцитарную пленку крови, внесенную в EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) во время виремической стадии заражения каприпоксвирусом (до генерализации поражений или в течение 4 дней генерализации), можно также использовать для выделения вируса. Образцы для гистологии должны содержать ткань из окружающей области и их незамедлительно после отбора помещают 10-кратно превышающий объем образца 10% формалиновый раствор или нейтральный забуференный 10% раствор формаля.
К транспортировке тканей в формалине не предъявляется специальных требований. Образцы крови, для выделения вируса из лейкоцитарной пленки, помещают в пробирку с аньтикоагулянтом, которую сразу помещают на лед и незамедлительно обрабатывают. На практике, образцы крови хранят при 4°C до 2 дней до обработки, но их не следует замораживать или хранить при температуре окружающей среды. Ткани и сухие корочки для выделения вируса, выявления антител и выявления генома предпочтительно хранить при 4°C, на льду или при - 20°C. При необходимости осуществить транспортировку образцов на большие расстояния без холодильника, среда должна содержать 10% глицерин; образцы должны быть достаточного размера, чтобы транспортная среда не проникала в центральную часть биопсийного материала, которая будет использована для выделения/выявления вируса.
Выделение вируса
Патологический материал, предназначенный для выделения вируса и выявления антигенов, гомогенизируют. Пример одного из методов для проведения гомогенизации: Ткань измельчают стерильными ножницами и щипцами, затем мацерируют в мельнице-смешивателе со стальными шариками или стерильным пестиком в ступке со стерильным песком и равным объемом стерильного фосфатно-буферного раствора (ФБР) или модифицированной среды Игла (МЕМ), с натрий-пенициллином (1000 международных единиц [МЕ]/ мл, сульфатом стрептомицина (1 мг/мл), микостатином (100 МЕ/мл) или фунгизоном (2,5 мкг/мл) и неомицином (200МЕ/мл). Гомогенизированную суспензию трижды замораживают-оттаивают, а затем частично очищают центрифугированием в настольной центрифуге при 600g в течение 10 минут. В случаях, когда предполагается бактериальная контаминация образца (когда, вирус выделяют из образцов кожи), надосадочную жидкость фильтруют через фильтр с порами 0,45 мкм после центрифугирования, однако, количество вируса в надосадочной жидкости может сократиться. Лейкоцитарные пленки можно приготовить из 5-8 мл некоагулированной крови путем центрифугирования при 600g в течение 15 минут; затем лейкоцитарные пленки осторожно переносят в 5 мл холодной воды двойной дистилляции с использованием стерильной пипетки Пастера. Через 30 секунд добавляют 5 мл холодной питательной среды двойной концентрации и перемешивают. Смесь центрифугируют при 600g в течение 15 минут, надосадочную жидкость отбрасывают, а клеточный осадок суспендируют в 5мл питательной среды, такой как модифицированная по методу Глазго среда Игла (GMEM). После центрифугирования при 600g в течение 15 минут, полученный осадок суспендируют в 5 мл свежеприготовленной GMEM. Или же, лейкоцитарные пленки можно отделить от гепаринизированного образца с помощью градиента плотности.
Каприпоксвирус выращивают в бычьей, овечьей или козьей тканевой культуре, хотя первичные или вторичные культуры клеток тестикул ягненка (LT) или почки ягненка (LK) считают наиболее восприимчивыми, в особенности, полученные от шерстных пород овец. Пример одного из методов выделения: или 1 мл суспензии лейкоцитарной пленки или 1 мл очищенного супернатанта биопсийного препарата инокулируют в 25 см2 колбу для тканевых
культур 90% слитых клеток LT или LK, супернатант абсорбируют в течение 1 часа при 37°C. Затем культуру промывают теплым ФБР и покрывают 10 мл пригодной среды, такой как GMEM, содержащей антибиотики и 2% фетальную телячью сыворотку. При наличии, также происходит инфицирование пробирок для тканевых культур, содержащих LT или LK клетки, и узкие покровные стекла или предметные стекла микроскопа для тканевых культур.
Колбы проверяют ежедневно в течение 7-14 дней на наличие цитопатического действия (ЦПД). Контаминированные колбы отбраковывают. У инфицированных клеток проявляется типичное ЦПД, которое демонстрирует ретракцию клеточной мембраны из окружающих клеток и, в результате, скругление клеток и скопление лейкоцитов по периферии ядерного хроматина. Сначала можно наблюдать только небольшие участки ЦПД, иногда на 4 день после заражения; через 4-6 дней они расширяются, охватывая весь клеточный пласт. Если ЦПД не наблюдается на 7 день, культуру подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, затем очищенный супернатант инокулируют на свежеприготовленную культуру LT или LK. При первых признаках появления ЦПД в колбах или ранее, если используется ряд инфицированных покровных стекол, покровное стекло следует удалить, зафиксировать в ацетоне и окрасить с использованием гематоксилина и эозина. Эозинофильные внутрицитоплазматические тельца-включения, различные по размеру, до не более половины размера ядра, и окруженные четкой каймой, свидетельствуют о заражении вирусом оспы. Образование сцинтий не свидетельствует о наличии каприпоксвирусной инфекции. Если причиной возникновения ЦПД является инфицирование клеточной культуры каприпоксвирусом, его можно предотвратить или отсрочить путем включения в среду специфичной антикаприпоксвирусной сыворотки; это способствует предварительной идентификации возбудителя. Некоторые штаммы каприпоксвируса адаптированы для выращивания на клетках почки африканской зеленой мартышки (Vero), однако они не рекомендуются для первичного посева.
Электронная микроскопия
Типичный вирион вируса оспы можно визуализировать с использованием методики приготовления с негативным окрашиванием с последующим наблюдением под электронным микроскопом. Существует множество различных протоколов негативного окрашивания, один из примеров приведен ниже:
Материал из исходной тканевой суспензии готовят для исследования на просвечивающем электронном микроскопе, до центрифугирования, путем помещения сетки с шестигранными отверстиями размером 400 меш с пилоформ-углеродным субстратом, активированный тлеющим разрядом в пентиламинном паре, на каплю суспензии, помещенной на парапленку или восковую пластину. Через 1 минуту сетку переносят на каплю буфера Tris/EDTA, pH 7,8, на 20 секунд, а затем на каплю 1% фосфорновольфрамовой кислоты, pH 7,2, на 10 секунд. Сетку просушивают фильтровальной бумагой, высушивают на воздухе и помещают в электронный микроскоп. Вирион вируса оспы коз имеет форму параллелепипеда, покрыт короткими цилиндрическими элементами, имеет размеры приблизительно 290 х 270 нм. Мембраны, полученные из клеток хозяина, могут окружать несколько вирионов, и для подтверждения внешнего вида следует исследовать их как можно больше (Kitching & Smale, 1986).
Вирионы каприпоксвируса неотличимы от вирионов ортопоксвируса, но, в отличие от вируса коровьей оспы ортопоксвирус не является причиной возникновения поражений у овец и коз. Однако каприпоксвирус отличается от вирионов парапоксвируса, которые являются причиной контагиозгого пустулярного дерматита, поскольку они меньше по размеру, имеют овальную форму и покрыты трубчатыми структурами, которые придают вид бороздок на вирионе.
Гистопатология
Материал для гистопатологии готовят стандартными методами. После приготовления, окрашивания гематоксилином и эозином и заливки фиксированного в формалине биопсийного материала, ряд срезов исследуют методом световой микроскопии. При гистологическим исследовании наиболее яркие виды поражений кожи в острой стадии представляют собой массивный клеточный инфильтрат, васкулит и отек. Ранние поражения характеризуются меченой периваскулярной инфильтрацией. Исходная инфильтрация осуществляется макрофагами, нейтрофилами и иногда эозинофилами, и по мере развития поражений, большим количеством макрофагов, лимфоцитами и плазмоцитами. Характерной чертой всех каприпоксвирусных инфекций является наличие изменяемого количества «клеток оспы овец» в слое дермы. Данные клетки оспы овец могут также появляться в других органах, где имеются микроскопические поражения оспы овец и коз. Данные клетки представляют собой крупные звездчатые клетки с эозинофильными, слабовыраженными внутрицитоплазмическими включениями и вакуолизированным ядром. Васкулит сопровождается тромбозом и инфарктом, вызывая отек и некроз. Эпидермальные изменения представляют собой акантоз, паракератоз и гиперкератоз. Изменения в других органах аналогичны с преобладанием клеточной инфильтрации и васкулита. Поражения верхних дыхательных путей характеризуются образованием язв.
Иммунологические методы