Антиген к каприпоксвирусу можно также идентифицировать на инфицированных покровных стеклах или предметных стеклах для тканевых культур с использованием реакций иммунофлуоресценции. Покровные стекла или предметные стекла промывают, просушивают и фиксируют в холодном ацетоне в течение 10 минут. Непрямой тест с использованием иммунной овечьей или козьей сывороток подвергают воздействию фонового окрашивания высокой интенсивности и неспецифичных реакций. Однако прямой конъюгат может быть приготовлен из сывороток реконвалесцентных овец и коз или гипериммунизированных очищенным каприпоксвирусом кроликов. Неинфицированные тканевые культуры следует включать в качестве отрицательных контролей, поскольку перекрестные реакции, благодаря антителам к антигенам клеточных культур, могут вызывать проблемы. Метод иммунофлуоресценции на срезах тканевых культур может также быть использован на готовых криостатных препаратах.
Методы распознавания нуклеиновых кислот
Амплификационные методы для выявления генома вирусной ДНК специфичны к роду Capripoxvirus и чувствительны для выявления на всем протяжении развития болезни, включая период до и после возникновения гуморальных иммунных реакций. Данные методы включают традиционную ПЦР, ПЦР в реальном времени и последнюю разработанную изотермическую амплификацию с формированием петель. Методы распознавания нуклеиновых кислот могут использоваться для выявления генома каприпоксвируса в биопсийных пробах, мазках или тканевых культурах.
Методы традиционной ПЦР
При проведении некоторых традиционных методов ПЦР сообщалось о различной степени специфичности для каприпоксвирусов в целом, вируса оспы овец или вируса оспы коз (Heine et al., 1999; Ireland & Binepal, 1998; Zro et al., 2014a). Традиционные методы ПЦР, в частности, пригодны для получения достаточного количества генетического материала, необходимого для идентификации видов путем последовательного секвенирования и филогенетического анализа (Le Goff et al., 2009).
Методы ПЦР в реальном времени
Разработаны и валидированы несколько высокочувствительных и основанных на специфичности выявления флуоресценции методов ПЦР (Balinsky et al., 2008; Bowden et al., 2008; Das et al., 2012; Stubs et al., 2012). Все тесты позволяют выявлять небольшой консервативный генетический локус в геноме каприпоксвируса, но эти методы не дифференцируют вирус оспы овец, вирус оспы коз или вирус нодулярного дерматоза. Описаны методы ПЦР в реальном времени для прямого генотипирования каприпоксвируса без необходимости генетического секвенирования (Gelaye et al., 2013; Lamien et al., 2011).
Изотермическая амплификация генома
Сообщают, что молекулярные исследования с использованием изотермической амплификации с образованием петли (LAMP) для выявления геномов каприпоксвируса обеспечивают чувствительность и специфичность аналогично методу ПЦР в реальном времени, являясь при этом, более простыми и недорогими (Das et al., 2012; Murray et al., 2013). Сообщалось о полевой валидации LAMP метода Das et al., 2012 (Omoga et al., 2016) и о комбинировании данного универсального теста на выявление каприпоксвируса с двумя дополнительными LAMP методами с целью демонстрации их практичности для дифференцирования вирусов оспы овец и оспы коз (Zhao et al., 2014).
Серологические тесты
Реакция вируснейтрализации
Тест-сыворотку либо титруют постоянным титром каприпоксвируса (100 TCID50 [50% инфекционная доза в тканевой культуре]) или стандартный штамм вируса титруют постоянным разведением тканевой культуры с целью подсчета индекса нейтрализации. В связи с разной чувствительностью тканевой культуры к каприпоксвирусу и последующей сложности обеспечить использование 100 TCID50, определение индекса нейтрализации является предпочтительным методом, хотя он и требует большего объема тест-сыворотки. Данный тест проводят с использованием 96-луночных микротитрационных плоскодонных планшетов для тканевых культур, но его можно проводить также и в колбах для тканевых культур с внесением соответствующих изменений в используемые объемы, хотя более затруднительным представляется считывание конечной точки титрования в колбе. Сообщают о получении более достоверных результатов при использовании Vero клеток в реакции вируснейтрализации (Kitching & Taylor, 1985).
Ход процедуры
i) Тест-сыворотки, включая отрицательный и положительный контроль, разводят 1/5 в среде Игла/ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) и инактивируют при 56°C в течение 30 минут.
ii) Затем, 50 мкл первой инактивированной сыворотки добавляют в колонки 1 и 2, ряды А-Н микротитрационного планшета. Вторую сыворотку помещают в колонки 3 и 4, третью - в колонки 5 и 6, положительную контрольную сыворотку помещают в колонки 7 и 8, отрицательную контрольную сыворотку помещают в колонки 9 и 10, и 50 мкл среды Игла/ HEPES без сыворотки помещают в колонки 11 и 12 и во все лунки ряда Н.
iii) Референтный штамм каприпоксвируса, обычно вакцинный штамм, который хорошо развивается в тканевой культуре, с титром, превышающим log10 6 TCID50 на мл разводят в среде Игла/ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) в мини-флаконах для получения логарифмических серий разведений log10 5.0; 4.0; 3.5; 3.0; 2.5; 2.0; 1.5 TCID50 на мл (эквивалент log103.7; 2.7; 2.2; 1.7; 1.2; 0.7; 0.2 TCID50 на 50 мкл).
iv) Начиная с ряда G и наиболее разведенного вирусного препарата, 50 мкл вируса добавляют в каждую лунку в данном ряду. Повторяют с каждым разведением вируса, наиболее высокий титр разведения вируса находится в ряду А.
v) Планшеты покрывают и инкубируют в течение 1 часа при 37°C.
vi) Клетки LT готовят из предварительно выращенных монослоев в качестве суспензии из 105 клеток/мл в среде Игла, содержащей антибиотики и 2% телячью фетальную сыворотку. После инкубирования микротитрационных планшетов 100 мкл суспензии клеток добавляют во все лунки, за исключением лунок H11 и H12, которые служат в качестве контрольных лунок для среды. Оставшиеся лунки ряда Н – контроли токсичности клеток и сывороток.
vii) Микротитрационные планшеты покрывают и инкубируют при 37°C в течение 9 дней.
viii) Монослои исследуют ежедневно через инвертационный микроскоп, начиная с 4 дня, на наличие ЦПД. В клетках ряда Н ЦПД не должно наблюдаться. Используя вакцинный штамм 0240 KSGP каприпоксвируса, на 9 день считывают окончательное значение, а титр вируса в каждом повторном разведении рассчитывают по методу Карбера. Если оставить на более длительный период, происходит «прорыв» вируса, при котором первоначально инактивированный вирус высвобождается из антитела.
ix) Интерпретация результатов: Индекс нейтрализации - это логарифмическая разница титров между титром вируса в отрицательной сыворотке и в тест-сыворотке. Индекс, составляющий ≥1,5, является положительным. Испытание можно сделать более чувствительным, если сыворотку от того же животного исследовать до и после заражения. Поскольку иммунитет к каприпоксвирусу является преимущественно клеточноопосредованным, отрицательный результат, в частности, после вакцинации, при которой реакция неизбежно слаба, не подразумевает, что животное, от которого была получена сыворотка, не является защищенным.
Реакция нейтрализации, при которой различные разведения вируса смешивают с неразведённой противовирусной сывороткой, описывали с использованием разведений сыворотки в диапазоне от 1/5 до 1/500 и фетальных клеток мышц теленка. Благодаря низкой чувствительности данных клеток к каприпоксвирусу по сравнению с LT клетками, проблема «прорыва» вируса решена.