ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение 3
ФИКСАЦИЯ 3
ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ 4
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫФИКСАЦИИ 5
ОКРАШИВАНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ 7
ВИДЫКРАСИТЕЛЕЙ 7
ОБЩИЕ МЕТОДЫОКРАСКИ 8
ОКРАСКА КЛЕТОК СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ И КРОВИ 8
ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ……………………...9
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 10
ЛИТЕРАТУРА 11
ВВЕДЕНИЕ
Общие приемы подготовки постоянного препарата производится с учетом единых принципов. В первую очередь, необходимо зафиксировать материал. После этого,как правило, его окрашивают, либо вводят метку, присоединяющуюся к тем или иным компонентам материала, и делают её видимой. Некоторые виды меток могут вводиться и прижизненно, ещё до фиксации. Тому, как можно окрасить препарат и какие существуют наиболее распространённые приёмы избирательного мечения клеточных компонентов, посвящен наш реферат.
ФИКСАЦИЯ
Важнейшим шагом подготовки препарата является фиксация - обработка, направленная на стабилизацию внешнего вида клеточных структур, расположения компонентов и даже молекул. Фиксация предохраняет эти структуры от посмертных изменений, от действия химических веществ, с которыми контактирует объект во время процедур, производимых при приготовлении препарата, от растворения в водных и спиртовых растворах красителей. Даже когда объект в принципе может наблюдаться прижизненно (например, клетки, выращенные на прозрачной подложке), именно фиксация позволяет различными способами окрасить эти клетки или применить специальные методы избирательного мечения компонентов, например, определённых белков или определённой последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах.
Из-за изменений условий окружения, возникающих при изъятии органа или фрагмента органа (отсутствие кровотока; наличие повреждённых клеток в ткани и др.), нарушается работа клетки и её структура, вплоть до гибели клетки. Погибая, клетка разрушается, и опять же её структура претерпевает изменения. Всё сказанное означает, что перед любыми обработками, которым необходимо подвергнуть клетку при подготовке препарата, необходимо произвести фиксацию.
ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ
В качестве фиксаторов в гистологических исследованиях часто применяются растворы, действие которых направлено на быстрое осаждение белков и образование с ними нерастворимых ковалентных соединений. По этому принципу действуют, например, формалин, спирт, сулема, уксусная кислота. Что именно должно быть сохранено при фиксации, зависит от задач исследования.
Иногда важно сохранить общую картину строения ткани, тогда фиксатор и последующая обработка не должны вызывать уплотнения и изменения объёма различных компонентов ткани, или приводить к появлению трещин между структурными компонентами с различающейся плотностью, и так далее. Фиксатор в этом случае должен быстро проникать на большую (несколько миллиметров) глубину, чтобы зафиксировать достаточно крупный фрагмент органа. Иногда важнее сохранность определенных клеточных органелл, и выбирается фиксатор, который может не столь быстро проникать вглубь образца, зато обеспечивает хорошую сохранность тонких структур, и особенно исследуемого компонента. Когда исследуется расположение в клетке определенного вещества, будь то липидные включения, железо или что-то ещё, фиксатор должен не только не разрушать их, но и предохранять их от действия клеточных ферментов, которые могут их метаболизировать. В качестве химических фиксаторов часто используют 4% формальдегид и другие альдегиды, спирты, кислоты, а также смеси на их основе.
Приведем несколько примеров широко распространенных фиксаторов, применяющихся для фрагментов ткани. Как правило, используют именно химические фиксаторы.
1. 4% формальдегид. Продолжительность фиксации 1-2 суток при комнатной температуре. Достоинством фиксатора является его быстрое проникновение в ткань, поэтому ткань фиксируется даже в 2-3 мм от поверхности, и толщина фиксируемого объекта может достигать 0,5 см. Кроме того, в формалине можно хранить зафиксированный материал.
2. Этиловый спирт. Используют для гистохимических реакций по выявлению гликогена, железа и др. Он осаждает белки, что ведет к частичному обезвоживанию ткани уже во время фиксации и, следовательно, упрощает проводку, однако не сохраняет липиды. Недостатком спирта как фиксатора является и резкое сморщивание ткани. Обычно фиксацию этанолом проводят при+5oC в течение 1-2 часов.
3. Смесь Карнуа. Это один из наиболее распространенных спиртовых фиксаторов. Его выгодно отличает высокая скорость проникновения, что делает возможным использование для фиксации труднопроницаемых объектов (например, насекомых, аскарид).
4. Жидкость Буэна – один из распространенных многокомпонентных фиксаторов. В нем можно хранить материал. Он универсален (отлично фиксирует эпителиальные ткани, железы, не применяется лишь для почек, семенников и мускулатуры) и хорошо сохраняет общую картину строения ткани.
5. Смесь Альтмана используется при изучении митохондрий и жировых включений.
Отсутствие единства объясняется тем, что все они имеют достоинства и недостатки, связанные со скоростью проникновения вглубь образца, со скоростью собственно фиксации, лучшей или худшей сохранностью отдельных клеточных структур или химических компонентов, степенью сжатия или набухания ткани в целом, и другие.
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫФИКСАЦИИ
Кроме химических, существуют и физические способы фиксации. Как правило, они применяются в специальных задачах гистохимии, в отдельных методах электронной микроскопии. Остаётся целый ряд проблем, которые полностью не решаются химической фиксацией:
1. потеря веществ, растворимых в фиксаторе;
2. смещение компонентов клетки вследствие диффузии;
3. агрегация в гранулы;
4. денатурация белков, потеря ферментативной активности, антигенных
свойств.
Когда обычные способы химической фиксации не могут быть применены, используют быстрое замораживание ткани до температуры приблизительно −160oC. В замороженном образце практически не идет диффузия, прекращается работа ферментов. Основной проблемой является кристаллизация воды: если кристаллы льда становятся крупными, они разрывают мембраны и разрушают клетки, естественно и морфологическая картина при этом будет совершенно нарушена. Однако можно подобрать режим охлаждения таким образом, что сохраняется даже ультраструктура образца. Охлажденный материал надо обработать так, чтобы при разморозке не продолжились химические процессы, шедшие в нем до заморозки.
Один вариант решения проблемы - лиофильная сушка. Материал выдерживают в вакууме при температуре −70 − −35oC, при этом возгоняется большая часть воды, кроме особенно прочно связанной.
Лиофильная сушка представляет собой наиболее бережную технологию, которая применяется для сушки разного рода скоропортящихся материалов. В основе принципа лиофильной сушки лежит непосредственный переход вещества из твердого состояния в газообразное, который называется лиофилизацией. Сначала продукт замораживают, а затем подвергают лиофильной сушке в среде пониженного давления. Низкое давление делает возможным прямой переход замороженного растворителя в пар. В большинстве случаев удаляемым из продукта при сушке растворителем является вода. Но могут использоваться и другие растворители – такие как этанол.
Лиофильная сушка используется главным образом для консервации материалов, требующих к себе бережного отношения и подверженных порче и разложению. Устойчивость продукта значительно возрастает за счет снижения в нем содержания воды.
Итак, фиксация - необходимый шаг в микроскопическом исследовании клеток и тканей.