Оплодотворение – теоретические аспекты

ПОКАЗАНИЯ К ЭКО

Важный научно-практичесикий аспект программы ЭКО и ПЭ представляет изучениепатогенеза бесплодия.Абсолютными показаниями являются трубное бес­плодие вследствие непроходимостиили отсутствия маточ­ных труб. Относительные показания:§ предшествовавшие оперативные вмешательства (пласти­ческие операции)на маточных трубах у женщины в возрасте старше 30 лет, если после операциипрошло более года;§ некоторые формы эндометриоза;§ бесплодие неясного генеза;§ иммунологическое бесплодие при постоянно высоком уровнеантиспермальных антител.Существуют генетические критерии отбора для ЭКО. Ме­тод не рекомендуется пригипоспадии, врожденных пороках сердца, шизофрении, аффективном психозе, приналичии в семье детей с аутосомно-рецессивными заболеваниями, риск повторногонаследования которых достигает 25 %. Противо­показаниями являются доминантнонаследуемые болезни.Большое внимание уделяется дальнейшему изучению патогенеза, профилактике илечению синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), представляющего собойсерьезное осложнение, возникающее при проведении стимуляции суперовуляции.Важное значение в реализации программы ЭКО и ПЭ имеют исследования ролиэндокринных нарушений, их профилактика и коррекция.В предварительном обследовании потенциальных пациентов программы ЭКО и ПЭнеобходимо уделять большое внимание исследованию содержимого цервикальногоканала у женщины в целях диагностики инфекций, относящих­ся к так называемойгруппе TORCH-комплекса (трихомонады, краснуха, хламидии и др.). Должнаосуществ­ляться не только их диагностика, но и лечение. Лишь пациенты,прошедшие соответствующую коррекцию, могут быть включены в программу ЭКО иПЭ.Необходима также тщательная кольпоскопия для исключения новообразований шейкиматки.За 2 – 3 мес. до ЭКО и ТЭ следует произвести тщательное обследование спермы,бактериологическое исследование и посев.Бесплодие у мужчин связано, как правило, с пере­несенными иминеспецифическими инфекционными заболеваниями (краснуха, корь), а также снеправиль­ным лечением ряда заболеваний, передаваемых поло­вым путем, а такжевенерических (например, гоно­рея). Причиной бесплодия может быть крипторхизм.Ряд вредных действий внешней среды, как бытового, так и промышленногопроисхождения, может являть­ся причиной нарушения сперматогенеза. ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫПРОГРАММЫЭКО И ПЭ Эмбриологический этап программы ЭКО и ПЭ является одним из важнейших,поскольку оценка качества ооцитов, их оплодотворение и куль­тивирование invitro до стадии преимплантационных эмбрионов во многом определяют ее успех.Ключевым моментом этого этапа программы являет­ся подбор адекватныхкультуральных сред и условий культивирования, приближающихся к естественнойсреде для преимплантационного развития. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ Культуральная среда для ЭКО должна быть мак­симально приближена по всемпараметрам к естест­венным жидкостям, в которых ооциты и эмбрионы человеканаходятся in vivo, т. е. маточных труб и мат­ки. После овуляции яйцеклеткапопадает в маточную трубу (ампулярный отдел), где и происходитоплодо­творение. Затем зигота и впоследствии эмбрион пере­двигается по трубев течение 4 - 5 дней, попадая в по­лость матки на стадии морулы.Практика показала, что многие среды, различаю­щиеся по составу, могут успешноимитировать есте­ственную среду для ооцитов и эмбрионов человека. Однакосуществует несколько основных харак­теристик, которым должны отвечатькультуральные среды. Уровень рН Уровень рН среды обычно должен равняться 7,4, что соответствует рН крови.Экспериментально было по­казано, что такая кислотность оптимальна дляопло­дотворения и преимплантационного развития эмбрио­нов человека. В качествебуферной системы обыч­но используется бикарбонатный буфер в присутствии 5% CO₂ в атмосфере. Этот буфер был выбран главным образом потому, что онсоответствует физиологиче­ской буферной системе крови, а парциальное давлениеCO₂ в легких составляет 40 мм рт. ст., что соответствует 5%.Для индикации уровня рН во многих средах ис­пользуется цветной индикатор –феноловый крас­ный, меняющий окраску с фиолетовой (через красную и оранжевую)на желтую при закислении среды – из­менении рН с 8,0 до 6,5. При рН 7,4 средас таким индикатором приобретает характерный красно-оран­жевый цвет.

Осмолярность

Важной характеристикой среды является ее осмолярность, определяемаяконцентрацией и константами диссоциации ее компонентов. Обычно осмолярностьравняется 285 мОсм/кг воды и соответствует таковой крови. Ооциты и эмбрионымлекопитающих обычно культивируются в открытых системах с максимальнодостижимой влажностью (80 - 90% в зависимости от модели CO₂-инкубатора), что предотвращает сильные колебания осмолярности в процессекультивирования.

Качество воды

Основой любой культуральной среды является вода, качество которой во многомопределяет успех культи­вирования. Для питательных сред используется вода,полученная после двойной дистилляции, ультрафиль­трации либо деионизации. Приэтом необходимо со­блюдение полной стерильности в процессе ее приготов­ленияи хранения. Эндотоксины, выделяемые бактери­ями, оставшимися в среде после ееультрафильтрации, могут оказать токсическое воздействие на эмбрионы.To жеможет произойти и при попадании бакте­рий в среду в процессе хранения.

Ионный состав

Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды длякультивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли со­боймодификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержанияжизни клеток – Na⁺, К⁺, Са²⁺, Mg²⁺, и , растворенные вбикарбонатном буфере (НCO₃). Также добавлялись антибио­тики дляпредотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина илисыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка использует­ся бычий иличеловеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческаясыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческаятрубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Болеесложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и былиразработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивированияэмб­рионов различных видов млекопитающих.Энергетическими субстратами для ооцитов и эмб­рионов млекопитающих вкультуральной среде обыч­но служат пируват, лактат и глюкоза, причемусвое­ние глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии несколькихклеточных делений, а до это­го предпочтительным источником энергии служитпи­руват.Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется ихприсутствием в жидкости яйце­водов многих видов млекопитающих. Было показано,что добавление глутамина в культуральную среду ока­зывает положительноевлияние на развитие эмбрио­нов многих видов млекопитающих. Однако привведе­нии в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаютсястабильны в условиях культивирова­ния – при температуре 37С многие из нихразруша­ются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладаеттоксическим эффектом.Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработанасреда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержитами­нокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – дажежирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в раз­личныхлабораториях. При том, что роль многих ком­понентов сложных сред до сих порне была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты. CO₂-ИНКУБАТОР Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO₃ в воздухе при тем­пературе 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условиясоблюдаются при использовании CO₃-инкубаторов, поддерживающихнеобходимую температуру, влаж­ность и уровень CO₂ в камере.Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа избаллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды.Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицин­скимстандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая угле­кислый газ, азот и кислород в нужной пропорции. Влажность в камере CO₃-инкубаторов поддержива­ется постояннымиспарением воды со дна камеры ли­бо из специального лотка. Также в некоторыхсовре­менных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух,позволяющая автоматиче­ски поддерживать влажность в камере до 90%.В связи с высоким уровнем влажности в инкубато­рах высок риск роста бактерийи плесени, поэтому не­обходима регулярная очистка всех поверхностей ка­меры.Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать этонадо с большой ос­торожностью, поскольку известно негативное влияниеэтилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе сфоллику­лярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulusoophorus (яйценосный буго­рок) представляет собой часть фолликулярногоэпите­лия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессефолликулогенеза. Помимо прочего фоллику­лярная жидкость содержит фибриноген,что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколь­ко минут послеаспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложнообнару­жить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используютсядва основных подхода:1. Фолликулярную жидкость просматривают под ми­кроскопом сразу послеаспирации и найденные ооци­ты незамедлительно помещают в среду для отмывки.2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду сгепарином, предотвращаю­щую образование кровяных сгустков.Как правило, в большинстве лабораторий руковод­ствуются вторым подходом. Приэтом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 млдобавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрациюгепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин неоказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона.Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательноотмывают в специальной среде.После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает вэмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается наприсутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирокпереливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопомили инвер­тированным микроскопом при небольшом увеличе­нии. Как правило,комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистыекомки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см.Найденные ооциты помещаются в среду для отмыв­ки, содержащую HEPES-буфер,позволяющий мани­пулировать с ооцитами на воздухе без риска измене­ния рН вщелочную сторону (такие среды производят­ся большинством фирм,специализирующихся на про­изводстве сред для ЭКО), затем отмываются вкультуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальнуючашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооци­тов икультивирование эмбрионов.Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды,покрытых слоем мине­рального масла, предварительно эквилиброванного скультуральной средой в присутствии 5% С0₂. Преиму­ществамикультивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральнуюсреду мик­роорганизмов и частичек пыли, возможность культи­вирования внебольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшойконцентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испаре­ния воды ивыхода CO₂ из среды вне инкубатора. Одна­ко, если капли со средойпод маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходномуравновесию влажности и концентрации CO₂ займет гораздо большевремени, чем в отсутствие масла.Манипуляции с ооцитами проводят с помощью от­тянутых стерильных пастеровскихпипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклян­ных(пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют идругие способы ма­нипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зави­сит отопыта и желания эмбриолога.Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценитьколичество, качество и сте­пень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Классификация комплексов ооцит-cumulus, применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж

	Ооцит	Характеристика
	Очень незрелый	Клетки cumulus и corona radiata плотно упакованы во­круг ооцита. Иногда можно увидеть ядро ооцита - за­родышевый пузырек. Такой ооцит находится на стадии профазы первого деления мейоза (GV-germinal vesicle stage), на которой происходит блок мейоза в процессе оогенеза. Полярное тельце еще не сформи­ровалось
	Незрелый	Клетки corona radiata все еще плотно примыкают к ооциту, cumulus незначительно увеличился. Такой ооцит обычно находится на стадии метафазы первого деления мейоза (М I), блок мейоза уже снят, однако формирование полярного тельца пока не произошло
	Преовуляторный	Клетки corona radiala расходятся лучами от ооцита, cumulus разросшийся, но имеет клеточную структуру. Ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза (М II), Полярное тельце уже сформировано
	Перезрелый	Присутствует небольшое количество клеток corona radiata, уже не примыкающих плотно к ооциту, который хорошо просматривается. Cumulus разросшийся, но все еще имеет клеточную структуру. Полярное тельце обычно хорошо видно
	Лютеинизированный	Вокруг ооцита клетки cumulus образуют скопления (комки), остальной cumulus представляет собой желе­образную массу с небольшим количеством клеток
	Дегенеративный	Несколько клеток гранупезы окружают ооцит, cumulus отсутствует или очень маленький. Ооцит обычно темноокрашен

Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, какправило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита.Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточночасто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако болееточное определение степени зрелости (если клетки co­rona radiata и cumulusудаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооци­таи увеличению риска полиспермии при оплодотворении.На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходестимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась послеудаления клеток cumu­lus.

Рис.2. Распределение ооцитов по степени зрелости ядра на момент ТВП: GV – стадия зародышевого пузырька (germinal vesic le) – очень незрелый ооцит; М I – стадия метафазы первого деления мейоза – незрелый ооцит; М II –стадия метафазы второго деления мейоза – зрелый ооцит; ATR –дегенератив­ный ооцит (См. рис. 3)

Рис.3. Ооцитарно-фолликулярные комплексы.а – незрелый; б – зрелый; в – пере­зревающий. Микрофотографии живых объектовв фазовом контрасте. ОБРАБОТКА СПЕРМЫПЕРЕД ОПЛОДОТВОРЕНИЕМ ООЦИТОВ in vitro Эякулят для ЭКО получают путем мастурбации в стерильный контейнер. Послеполного разжижения спермы, происходящего при комнатной температуре через 30 -60 мин, приступают к ее обработке. Предва­рительно необходимо провести анализконцентрации сперматозоидов, их подвижности и морфологических характеристикпо стандартной методике ВОЗ.Перед тем как добавлять сперму в культуральную среду с ооцитами, необходимоее обработать в целях удаления семенной плазмы и получения максимальнополноценной фракции прогрессивно подвижных спер­матозоидов. На практикеприменяются два основных метода обработки спермы - центрифугирование-фло­тация (процедура swim-up) и градиентное центрифуги­рование.При использовании методики swim-up 1 – 2 мл спер­мы помещают в коническую 10 –15-миллиметровую пробирку, добавляют 5 - 10 мл среды для отмывки* и центрифугируют 5 – 10 мин при ускорении 1200 g. За­тем супернатантудаляют, осадок ресуспендируют в 2 – 3 мл среды и вновь центрифугируют. Послеудаления супернатанта 1 – 2 мл свежей среды осторожно наслаи­вают на осадок,пробирку помещают в CO₂-инкубатор при 37°С на 30 – 60 мин. В течениеэтого времени по­движные сперматозоиды должны мигрировать в насло­енную среду,оставив на дне пробирки неподвижные сперматозоиды, дебрис и иные клетки. Еслипробирки будут установлены наклонно, увеличится площадь контакта осадка сосредой и, соответственно, выход по­движных сперматозоидов. Для определениякон­центрации и подвижности сперматозоидов в надосадочной жидкости беретсяаликвота 10 или 50 мкл. Затем необходимое количество чистого супернатанта исполь­зуется для инсеминации. Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение методацентрифугирования в градиенте Перколла. Перколл пред­ставляет собой суспензиюсиликоновых гранул 15 – 30 нм в диаметре, покрытых слоем поливинилпирролидона(PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколлаявляется очень низкая осмолярность – 25 мОсм/л, поэтому при раз­ведении всреде до различных концентраций, соответ­ствующих различным плотностям (от1,01 до 1,13 г/л), осмолярность растворов остается постоян­ной. РастворыПерколла (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9час­тей Перколла и 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки.Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40%-гоПеркол­ла на 1,5 мл 90%-го в конической пробирке; сверху аккуратнонаслаивается сперма (1 – 2 мл), и вся эта трехслойная колонкацентрифугируется 15 мин при ускорении 700 g. После центрифугирования в осадокпопадают только функционально нормальные сперма­тозоиды; неподвижные ианомальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермызадержи­ваются на границе 40 и 90%-q фракций. Осадок отбирается пастеровскойпипеткой и два раза отмыва­ется в специальной среде, как и в случаеприменения методики swim-up (см. выше).Последний метод, по мнению многих авторов, явля­ется более предпочтительным,сочетая в себе хорошую сепарацию и высокий выход фертильных сперматозо­идов.Кроме того, описано и защитное действие Перколла: он не позволяет попасть восадок дефект­ным сперматозоидам, лейкоцитам и другим клеткам спермы,производящим большое количество свобод­ных радикалов, способных повреждатьмембраны сперматозоидов. Таким образом, чем более благо­приятно соотношениежизнеспособных сперматозои­дов и дефектных, тем меньше вероятностьповрежде­ний первых. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ООЦИТОВ in vitro Много споров и разночтений вызывает вопрос о времени введения сперматозоидовв среду, где культи­вируются ооциты. Наиболее общепринятым считает­ся, чтомежду выделением первого полярного тельца ооцита (достижением стадии М II) идобавлением спермы должно пройти около 4 ч, тогда способность такого ооцита коплодотворению и последующему дроблению будет максимальной.Преовуляторный фолликул на момент аспирации (обычно 36 ч после введенияхорионического гонадотропина - ХГ, имитирующего пик эндогенного ЛГ в моментовуляции при естественном цикле), как пра­вило, содержит ооцит на стадии МII. В естественных условиях овуляция, а значит, и возможность оплодо­творениянаступает через 38 - 40 ч после пика ЛГ.На практике преинкубация ооцитов перед инсеминацией составляет от 2 до 6 ч.Данные по влиянию времени инкубации на оплодотворяемость ооцитов, дроблениеэмбрионов и беременность разноречивы. По данным К. Yanagida с соавт.,исследовавших такую за­висимость при инкубации ооцитов в течение 1 - 11 чпе­ред оплодотворением (применялся метод интрацитоплазматическоймикроинъекции сперматозоида в яйцеклетку - ИКСИ), способность ооцитов коплодот­ворению, последующему дроблению и имплантации статистическидостоверно снижается при инкубации их более 9 ч. Достоверных различий приинкубации в течение 1 - 9 ч не было обнаружено. В другом ис­следовании былопоказано, что инкубация более 9 ч перед оплодотворением наиболее оптимальнадля по­следующего прохождения всех вышеуказанных про­цессов при ИКСИ;исследователи предполагают, что это связано с дозреванием цитоплазмы ооцита,необхо­димым для его активации при оплодотворении.Важным моментом в обеих работах является то, что инкубация ооцитовпроисходила в присутствии кле­ток cumulus и corona radiata. Известно, чтосозрева­ние ооцита полностью зависит от окружающих клеток фолликулярногоэпителия, поставляющих в ооплазму РНК и белки, необходимые для развитиябудущего организма до включения его собственного генома, а также белковыефакторы, отвечающие за процесс оп­лодотворения. Было показано, что дозреваниеооцитов in Ditro со стадии GV до стадии МII при интактном cumulusпроисходило с большей вероятностью, при­чем последующее их оплодотворение идробление бы­ло лучше.Несмотря на расхождение данных, большинство ав­торов считает, чтопреинкубация обязательно необхо­дима, а ее оптимальная длительностьподбирается эм­пирически в каждой лаборатории. При этом окно оп­лодотворениядля зрелого ооцита достаточно широко, однако преждевременное оплодотворениенедозревших ооцитов может негативно повлиять на исход дробления и имплантацииэмбрионов.Помимо фактора времени, в инсеминации важным является и количественныйфактор. Количество про­грессивно подвижных сперматозоидов обычно должносоставлять 50 - 100 тыс. на 1 мл среды (при культиви­ровании в относительнобольшом объеме среды) либо на ооцит (при культивировании в микрокаплях подминеральным маслом). Подбирая концентра­цию сперматозоидов приоплодотворе­нии ооцитов in vitro, нужно иметь в виду, что при добавлениименее 50 тыс. активно подвижных сперматозоидов на 1 мл частота оплодотворениябудет существенно снижена, а при использовании очень вы­соких концентрацийвозникают побочные эффекты: полиспермия (проникновение более одногоспермато­зоида в ооцит при оплодотворении), снижение жизне­способностиполученных эмбрионов (за счет повреж­дения кислородными радикалами, припопадании погибающих или мертвых сперматозоидов, либо воз­действияизбыточного количества литических акросомальных ферментов).Однако это правило реализуется лишь в случае нор­мальной морфологиисперматозоидов, при наличии необходимой концентрации активно подвижныхспер­матозоидов в эякуляте, отсутствии дефектов акросомальной реакции илиотсутствии больших концентра­ций антиспермальных антител в сперме (MAR-тестменее 50%). При наличии этих и других отрицатель­ных факторов, а также принеудаче оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО концентрация сперматозо­идовможет быть повышена путем снижения объема среды культивирования(культивирование в микро­каплях, соломках для криоконсервации,микрокапил­лярах), однако это далеко не всегда приводит к жела­емымрезультатам. Для облегчения проникнове­ния сперматозоида в ооцит клеткиcumulus и corona radiata могут быть удалены ферментативно и механи­чески,однако это повышает риск полиспермии.

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ – ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

Оплодотворение представляет собой слияние двух гамет - ооцита исперматозоида, влекущее за собой слияние их гаплоидных наборов хромосом иразвитие нового организма. Зрелый ооцит к моменту оплодотворения пред­ставляет собой одну изнаиболее больших клеток ор­ганизма - 110 - 120 мкм в диаметре, окруженнуюблестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими слоями клеток лучистого венца(corona radiata) и большим числом клеток яйценосного бугорка (cumu­lusoophorus). К этому времени в ооците, как прави­ло, уже завершилось первоеделение мейоза, в ре­зультате которого отделилось первое полярное тель­це, авторое деление мейоза находится на стадии метафазы. Хромосомы располагаются вряд, образуя метафазную пластинку, непосредственно под поляр­ным тельцем. Наэтой стадии в ооците происходит блок мейоза, который снимается лишь припроник­новении сперматозоида. Зрелый сперматозоид имеет уплощенную гру­шевидную головку длиной около 6мкм и шириной в экваториальном сегменте около 4 мкм, состоящую главным образомиз ядра и акросомы, которая со­держит литические ферменты и расположена в видешапочки над верхней половиной головки. Хвост сперматозоида имеет длину около 50мкм и начина­ется от головки в районе шейки, где расположены центриоль икомплекс митохондрий. Митохондрии отвечают за обеспечение энергией процессадвиже­ния сперматозоида, осуществляемого хвостом. В структуре сперматозоида нетничего лишнего, все имеет только одну цель – доставить генетический материал,содержащийся в головке сперматозоида, в ооцит.Способность сперматозоида к оплодотворению in vivo или In vitro появляетсялишь после капацитации, под которой in vivo понимается весь комплексбиохи­мических и ультраструктурных изменений, которые претерпеваетсперматозоид, проходя путь через жен­ский половой тракт до встречи с ооцитом.Эти измене­ния затрагивают в основном мембрану головки спер­матозоида.Капацитация in vitro происходит во время обработки и инкубирования спермы дооплодотворе­ния, однако она невозможна при отсутствии в средах для отмывки икультивирования альбумина.При оплодотворении in vivo в трубе присутствует лишь небольшое количествосперматозоидов, проде­лавших весь долгий путь от влагалища до ампулярногоотдела маточной трубы. Для нормального оплодо­творения in vitro их необходимоне менее 50 тыс. на ооцит. Однако при подсчете количества сперматозои­дов,непосредственно атакующих ооцит in vitro, их на­считывается до 2 - 3 тыс. Досих пор неясно, почему количество сперматозоидов должно быть так велико вискусственных условиях. Возможно, это объясняется недостаточнойфизиологичностью среды либо боль­шим размером массы cumulus у ооцитов,получаемых при ТВП, чем in vivo.Прежде чем попасть в ооцит, сперматозоид должен преодолеть несколькобарьеров. Первым из них явля­ется cumulus, представляющий собой растянутыйматрикс, состоящий преимущественно из полигиалуроновой кислоты, с редкорасположенными клетками. Преодолеть этот барьер может только капацитированныйсперматозоид с интактной акросомой. По мере продвижения внутрь cumulusповедение сперматозои­да изменяется: резко возрастает скорость, двумерныедвижения становятся трехмерными - наступает фаза гиперактивности. In vitroпервый барьер спер­матозоидам помогает преодолевать фермент гиалуронидаза,выделяющаяся при разрушении акросом гибнущих сперматозоидов; однако такаяситуация не является физиологичной.После прохождения cumulus сперматозоид достига­ет zona pellucida, гдепроисходит его связывание с ре­цептором. В отличие от мышей, рецепторы zоnаpellu­cida которых давно выделены и охарактеризованы, таковые человека до сихпор точно не определены. Имеется предположение, что это так называемыйан­тиген к оплодотворению - FA-1, гликопротеин, кото­рый при добавлении всреду полностью блокирует свя­зывание сперматозоидов с zona pellucida.Связывание сперматозоида возможно только при интактной акросоме и нормальнойморфологии голов­ки, поскольку рецепторы сперматозоида к гопа pellu­cidaрасположены на акросоме. Затем происходит акросомная реакция - мембранаакросомы и цитоплазматическая мембрана ооцита сливаются, содержимое акросомы(главным образом, фермент акрозин, спо­собный к локальному растворениюгликопротеинов, из которых состоит гопа pellucida) выбрасывается в местесвязывания с гопа pellucida и сперматозоид ин­тенсивно продвигается сквозьоболочку ооцита, все еще находясь в фазе гиперактивности.Попадая в перивителлиновое пространство, спер­матозоид прикрепляется крецепторам на мембране ооцита комплементарными рецепторами, расположен­нымина экваториальной части головки под акросо­мой. Связывание сперматозоида срецепторами на плазматической мембране мгновенно вызывает так называемуюкортикальную реакцию - массовый экзоцитоз гранул, расположенных по периферииооцита (cortex}, что приводит к необратимым измене­ниям zona pellucida,делающим ее непроходимой для остальных сперматозоидов. Это является основныммеханизмом предотвращения полиспермии у млеко­питающих. Далее начинаетсяпроцесс слияния мемб­ран сперматозоида и ооцита, в результате которогосперматозоид целиком как бы заглатывается ооцитом (процесс очень напоминаетфагоцитоз).Сразу после слияния гамет ядерная мембрана спер­матозоида разрушается,хроматин деконденсируется под влиянием факторов ооплазмы. Одним из этихфак­торов, возможно, является так называемый фактор деконденсации ядрасперматозоида (SNDF). Ооцит также активируется, мейоз возобновляется,выделяет­ся второе полярное тельце. Механизм активации ооци­та пока изученнедостаточно, однако известно, что фактор активации выделяетсясперматозоидом. Ядерный материал ооцита окружается оболочкой - формируетсяженский пронуклеус. Вокруг хрома­тина сперматозоида формируется мужскойпронукле­ус, в обоих пронуклеусах идет синтез ДНК. Мужской и женскийпронуклеусы начинают движение по на­правлению друг к другу и встречаются вцентре ооци­та. Через несколько часов после встречи мембраны пронуклеусовразрушаются, и генетический материал обеих гамет сливается (сингамия). Наэтом этапе про­цесс оплодотворения завершается - возникает зигота. Хроматинзиготы конденсируется, и хромосомы подго­тавливаются к первому делениюдробления.На следующий день после аспирации ооциты пере­носят в лунку со свежейкультуральной средой и очи­щают от клеток лучистого венца пастеровскойпипет­кой с оттянутым до диаметра 150 - 160 мкм кончиком и просматривают напредмет присутствия признаков оплодотворения. Пронуклеусы видны в ооците дажепри наблюдении в стереомикроскоп х 80. Они появля­ются, как правило, через 10- 16 ч после добавления сперматозоидов в среду с ооцитами и исчезают через 6- 8 ч после появления. Если присутствуют оба пронуклеуса - оплодотворениесчитается нормальным. Если их не удается обнаружить - оплодотворение несостоялось. Если виден один пронуклеус либо больше двух - произошлоаномальное оплодотворение.Примерно в 30% случаев в ооцитах после оплодо­творения in vitro не выявляютсяпронуклеусы, что мо­жет быть связано как с несостоявшейся пенетрацией ооцита(низкая концентрация активных сперматозои­дов, дефекты в механизмах адгезиисперматозоида, отсутствие рецепторов на zona pellucida и/или мембра­неооцита), так и с незрелостью ооцита на момент оп­лодотворения, а также сналичием хромосомных ано­малий у ооцита (диплоидия, анеуплоидия).При наличии в ооплазме одного пронуклеуса (около 3 - 6%) в половине случаевоплодотворение все же происходит, однако пронуклеусы формируются асин­хронно.Происхождение таких зигот может быть раз­личным: гиногенетическим (изооцита), андрогенетическим (из сперматозоида) либо возникшим в резуль­татеслияния мужского и женского пронуклеусов. Отличить на практике этоневозможно, поэтому реко­мендуется: во-первых, просматривать ооциты насле­дующий день после инсеминации несколько раз, чтобы избежать ошибки; во-вторых, не переносить в полость матки эмбрионы, полученные изоднопронуклеарных зигот.Полипронуклеарные зиготы - 3 и более пронукле­усов - составляют, как правило,5 - 10% от всех оп­лодотворенных ооцитов и возникают главным образом припроникновении в ооцит более одного сперматозо­ида (в случае добавленияизбыточного количества сперматозоидов при инсеминации, при дефектахкор­тикальной реакции, при незрелости или перезрелости ооцита). Также описаныслучаи неотделения второго полярного тельца после завершения мейоза,генетиче­ский материал которого формирует третий пронукле­ус.Полипронуклеарные зиготы, как правило, не развиваются нормально, эмбрионы,полученные из таких зигот нельзя переносить в полость матки. В естественныхусловиях такие эмбрионы иногда имплантируются, однако чаще всего такаябеременность заканчивается выкидышем либо мертворождением. Рис. 4. Яйцеклетки и зародыши человека на различных этапах культивиро­вания.а – ооцит с первым полярным тельцем; б – пронуклеусы: в и г – зародыши наста­диях 4 и 8 бластомеров. Микрофотографии живых объектов в фазовомконтрасте. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ Эмбрионы, полученные после оплодотворения ооцитов одной и той же пациентки,часто отличаются по скорости дробления и морфологическим парамет­рам.Общепризнанным считается, что максимальную способность к имплантации имеютэмбрионы с наи­большей скоростью дробления, бластомеры которых имеютрегулярную форму, а безъядерные фрагменты отсутствуют. Такие эмбрионы относятк классу 1 (А). Градация эмбрионов по качеству является условной иразличается в разных лабораториях. Однако в ос­нове ее лежит, как правило,характер фрагментации эмбриона, форма и размер бластомеров. Так, эмбрион снеравными бластомерами и/или фрагментами ци­топлазмы, занимающими менее 10%объема, соответ­ствует классу 2 (В); при наличии фрагментации 10 - 50% -классу 3 (С), более 50% - классу 4 (D).Работы по анализу влияния качества переносимых в полость матки эмбрионов начастоту их имплантации многочисленны, но трудносопоставимы в силу разныхметодик оценки качества. Около 20% переносимых эмбрионов А-В классаимплантируются, однако эта частота падает до 1,5% для сильнофрагментированных эмбрионов. Впечатляют результаты клиники Bourn Hall(Англия), в которых показано, что 90% пациенток, забеременевших после ЭКО иПЭ, по­лучали при переносе эмбрионов хотя бы один эмбрион класса А. В той жеработе не было выявлено зависимо­сти между качеством переносимых эмбрионов ичасто­той невынашивания беременности. СТРАТЕГИЯ ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ Количество переносимых эмбрионов обычно со­ставляет не более 2 - 3, посколькупри увеличении чис­ла эмбрионов до 4 и более частота беременности, какправило, не возрастает, но увеличивается риск моногоплодной беременности, чтовлечет за собой серьез­ные проблемы акушерского характера. Однако вот­дельных случаях допускается перенос большего числа эмбрионов - примногократных неудачных попытках ЭКО и ПЭ и при возрасте пациентки старше 40лет. В данном случае при последующих переносах шанс наступления беременностиснижается, и авторы пытаются использовать возможность наступлениябе­ременности за счет увеличения количества переноси­мых эмбрионов. Но такойподход не является науч­ным, так как в этих случаях не всегда ясна причинанеудач, т. е. мы часто имеем дело с так называемым «бесплодием неяснойэтиологии».Что касается интервала между моментом оплодо­творения ооцитов и временемпереноса эмбрионов, то здесь существует несколько основных подходов. На зареразвития метода Эдварде и Стептоу переносили в полость матки эмбрионы,достигшие стадии 8 - 16 бла­стомеров на 3 - 4-е сутки культивирования,имитируя естественные условия. Однако впоследствии было выявлено, что болееранние эмбрионы также пригод­ны для переноса и имплантируются с той жевероят­ностью.Через 48 ч после аспирации фолликулов (2-е сутки культивирования) эмбрионы,как правило, находятся на стадии 2 - 4 бластомеров, но встречаются и стадии 6- 8 бластомеров. Перенос эмбрионов на 2-е сутки наи­более общепринят: ужеимеется возможность отобрать эмбрионы по качеству и скорости дробления,однако пребывание в условиях культуры, являющихся в лю­бом случае менееоптимальными, чем естественные, еще не слишком длительно.Интересен тот факт, что способность эмбриона к им­плантации напрямую зависитот скорости его дробле­ния. Так, в исследовании Staessen с соавт. припереносе эмбриона хорошего качества на стадии 2 и 4 бластоме­ров частотаимплантации составила 14 и 21% соответ­ственно. В другой работе сообщается,что если перенесенные эмбрионы достигали стадии не более 2 бластомеров,частота наступления беременности составляла 9,3%, но возрастала до 35,8%,если хотя бы один эмбрион был на более чем двуклеточной ста­дии.На 3-и сутки культивирования нормально развива­ющиеся эмбрионы достигаютстадии 6 - 8 бластомеров и выше. К этому моменту выбор эмбр