Образование свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода, является неизбежным явлением, связанным с аэробной жизнью. Предпосылкой для функционирования и развития клеток в кислород-содержащей среде является наличие защитных систем, включающих специализированные ферменты и низкомолекулярные антиоксиданты. Фенольные соединения, оказывается, являются эффективными неэнзиматическими защитниками (протекторами) от окислительного стресса. Они могут выступать как антиоксиданты в различных направлениях. Они могут не допускать (препятствовать) ионы переходных металлов с момента начала окисления, подавлять промежуточные соединения окисления (в том числе активные формы кислорода) и ингибировать различные прооксидантные ферменты.
Длинноцепочечные 5-н-алкил(ен)резорцинольные гомологи предотвращают Fe2+-индуцированную пероксидацию жирных кислот и фосфолипидов в липосомальной мембране и процессы автоокисления триглицеридов и жирных кислот. В миллимолярной концентрации алкилрезорцины из бактерий и зерен хлебных злаков подавляют Fe2+-аскорбиновую кислоту и Fe2+-НАДН-индуцированное перекисное окисление в микросомах печени полностью и то же в саркоплазматическом ретикулуме частично. Они также были эффективны в защите мембраны эритроцитов против перекисно-индуцированного окисления. Также были оценены антиоксидантные свойства алкилрезорцинов ржаных отрубей с использованием их радикал-нейтрализующей активности 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и метода хемилюминесценции. Радикальное сокращение 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила варьировалось от 10 до 60% для алкилрезорцинольных гомологов в концентрации 5-300 мкM и не зависело от длины алкильной боковой цепи отдельного гомолога. Эти результаты были подтверждены с помощью дальнейших исследований. 5-н-алкилрезорцины (C15, C17, C19, C21 и C23) не оказывали мощного антиоксидантного действия на способность плазмы восстанавливать железо и радикалы 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила. Тем не менее, они были способны значительно ингибировать медно-опосредованное окисление липопротеинов низкой плотности человека в пробирке и увеличить самозащитную способность раковых клеток толстой кишки человека НТ29 при нанесении ущерба (удара по) ДНК, индуцированного перекисью водорода. Точные механизмы защитного эффекта резорцинольных липидов клеточных структур от окисления до сих пор неизвестны.
C7-алкилоксибензол, химический аналог ауторегулятора микробного анабиоза, защищает клетки дрожжей от активных форм кислорода, произведенных под гамма-излучением. Этот эффект проявляется как в сохранении жизнеспособности клеток при облучении, так и в восстановлении их способности размножаться после облучения. Защитный механизм C7-алкилоксибензола включает акцептирование активной формы кислорода в результате окислительного стресса. C7-алкилоксибензол также показал способность защищать клетки от фотоокисления. Влияние алкилоксибензолов на сопротивляемость клеток S. cerevisiae к тепловому шоку и окислительному стрессу летальной интенсивности зависело от гидрофобности исследованных соединений. С7-алкилоксибензол в концентрации 0,25-0,5 г/л вызывал два-пятикратное увеличение в сопротивляемости дрожжевых клеток к перекиси водорода, в то время как С12-алкилоксибензол уменьшал ее во всех концентрациях. C7-алкилоксибензол и C12-алкилоксибензол имели похожий эффект на дрожжи, подвергавшиеся тепловому шоку.
Антиоксидантные свойства фенольных липидов, проявляющиеся как способность акцептировать радикалы и ингибировать ферменты, участвующие в выработке свободных радикалов в физиологических условиях, свидетельствуют о возможном участии этих соединений в защите клеток против канцерогенеза. Ксенобиотики, которые вызывают мутагенные процессы, активизируются во многих случаях за счет процессов окисления. Алкилрезорцины демонстрируют отсутствие мутагенного, канцерогенного и коканцерогенного эффектов. Это может говорить о возможности их применения в фармакологии и медицине. Препарат, содержащий смесь преимущественно гомологов с ненасыщенной цепью (C15-C27), резко тормозил влияние прямых и косвенных (метаболически активных) мутагенов. Эффект был сильнейшим в случае косвенно действующих мутагенов бензо[a]пирена и 2-аминофлуорена, из-за которых наблюдалось более чем 50% ингибирование. Для напрямую действующих мутагенов, таких как метилметансульфонат и даунорубицин, влияние резорцинольных липидов было меньше. В тесте обмена сестринскими хроматидами, культивируемых in vitro лимфоцитов, полученных из крови человека, также наблюдалось значительное уменьшение в частоте обмена сестринскими хроматидами, вызванное бензо[a]пиреном. Это было подтверждено в дальнейших экспериментах с использованием теста микроядер, блокированных цитокинами и теста сопротивляемости тиогуанину. Резорциновые липиды значительно снижали темпы и частоту мутаций, вызванных в культивируемых лимфоцитах бензо[a]пиреном и митомицином С.
Антигенотоксическое влияние было показано для 5-н-алкилрезорцинов в клетках рака толстой кишки человека HT29. Повреждения ДНК, вызванные пероксидом водорода, были значительно снижены, а ответа к длине цепи не наблюдалось. Снижение генотоксичности от пентадецилрезорцина было примерно на 40%, от генейкозилрезорцина - 10%. Метилрезорцин и гексилрезорцин повышали сопротивляемость к УФ-излучению различных молекул ДНК разного происхождения и конформации (линейная ДНК фага лямбда, ДНК из селезенки крупного рогатого скота и ДНК плазмиды pUC19). Разрушение ДНК при облучении ультрафиолетовым светом в присутствии исследуемых соединений было сравнительно невелико и зависело от химической структуры и концентрации соединения. Исследования с использованием плазмиды pUC19 показали, что изучаемые алкилрезорцины препятствовали переходам от сверхспирализованной кольцевой формы в спокойном состоянии к сверхспирализованной линейной раскрученной форме.
Было показано, что мерулиновые кислоты в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляли синтез ДНК и РНК и синтез белка в клетках Bacillus brevis. Похожие ингибирующие свойства были показаны для 5-н-децилрезорцина в изолированных тимоцитах крысы.
Бактерии рода Lactobacillus, обладающие способностью синтезировать оксид азота (NO) неденитрификационным путем, не индуцируют его синтез в присутствии ауторегуляторных молекул: плотностно-зависимого специфического регулятора гомосеринлактона и неспецифического – гексилрезорцина. Прямыми методами регистрации с использованием флуоресцентных красителей показано, что, в отличие от NO-синтазной активности, содержание активных форм кислорода в клетках лактобацилл при действии исследуемых сигнальных молекул возрастает, причем воздействие гексилрезорцина более выражено по сравнению с действием гомосеринлактона.
Установлено, что увеличение биосинтеза оксида азота (NO) в клетках Lactobacillus plantarum 8Р-А3 происходит при сильном стрессовом воздействии, сопровождающемся значительным снижением жизнеспособности микробных клеток: нагревании при 70 и 80˚C, продолжительном культивировании, токсическом действии гексилрезорцина. Активация биосинтеза NO в ответ на стрессовые воздействия свидетельствует в пользу универсальности ключевых механизмов стресс-ответа клеток различного уровня организации и важной роли в них NO.
Было проведено исследование роли АОБ в ответе бактериальных клеток на температурное воздействие, оцениваемое по уровню биолюминесцентного отклика E. coli ibpA’::lux, соответствующего индукции белков теплового шока (в частности, белка-шаперона IbpA). Проведение предварительного эксперимента, направленного на выявление собственного влияния АОБ в отношении штамма E. coli ibpA’::lux, позволило обнаружить дозозависимые эффекты на уровень свечения и ростовую способность клеток. Основанный на этих данных расчёт фактора индукции биолюминесценции (Fi) позволил выявить зависимость экспрессии стрессовых регулонов от концентрации АОБ, выраженную в слабой индукции гена ibpA малыми концентрациями ауторегуляторов, но в значительной репрессии указанного гена при увеличении присутствия данных молекул до концентрации 10–3 М.
Проведённое комплексное исследование эффектов АОБ на уровень активации SOS-системы при воздействии УФ-излучения позволило обнаружить существенную репрессию SOS-ответа, прогрессирующую с увеличением длины алкильного радикала, а следовательно, и гидрофобности молекулы. Результаты свидетельствуют о преимущественно ингибирующем характере влияния АОБ на SOS-ответ клеток при их облучении летальной интенсивности на фоне сохранения исходного количества жизнеспособных клеток.
Длинноцепочечные гомологи в небольших концентрациях (10–6 и 10–5 М) индуцируют активацию SoxS-регулона, в концентрации 10–4 М демонстрируют антиоксидантные эффекты, снижая уровень биолюминесценции ниже контрольных значений, и при увеличении их присутствия до 10–3 М приводят к отключению стрессового регулона. Короткоцепочечные АОБ блокируют активацию регулона с одновременным снижением чувствительности бактериальных клеток к воздействию окислителя, что выражается в сохранении большего количества жизнеспособных клеток; защитный эффект возрастает с увеличением концентрации АОБ.
Резорцинольные липиды обладают способностью к разрезанию ДНК. 5-н-тридецил и 5-н-пентадеценилрезорцины, присутствующие в экстракте растения Hakea sp., показали способность Cu2+-индуцированного разрезания реплицированной нити в плазмидной ДНК uX174. Кроме того, несколько бис-(дигидроксиалкилбензолов) были также посредниками Cu2+-зависимого расщепления ДНК. Активность резорцинольных липидов увеличивается с ростом числа атомов углерода в алифатической цепи. Это говорит о том, что алкилрезорциновые молекулы взаимодействуют с двойной спиралью ДНК путем вставки цепей в его внутреннюю структуру. Алкилрезорцин-индуцированное разрезание цепи нуклеиновой кислоты связано с выработкой гидроксильных радикалов посредством окисления при высоком pH в присутствии Cu2+, O2 и алкилрезорцина. Алкилрезорциновая активность увеличилась в присутствии кислорода, что позволяет предположить, что расщепление ДНК 5-н-алкилрезорцином включает окисление бензольного кольца до тригидрокси-производных, способных восстановить медь для последующего формирования активных форм кислорода.
Описано формирование упорядоченных линейных надмолекулярных структур высокополимерной ДНК, происходящее в водных растворах в присутствии низкомолекулярных лигандов из группы алкилрезорцинов (АР). С использованием атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии визуализированы последовательные этапы подобного процесса: на первом происходит первичное взаимодействие между молекулами за счет взаимодействий алкильных радикалов алкилрезорцинов с гидрофобными участками ДНК, далее они скапливаются на ДНК, образуя мицеллоподобные наноструктуры, что вызвано их амфифильными свойствами и происходит в отдельных участках ДНК. На последнем этапе аранжированные низкомолекулярным лигандом молекулы ДНК начинают взаимодействовать друг с другом, что приводит к формированию упорядоченных тяжистых структур, состоящих из множества параллельно расположенных нитей ДНК.
Было документально подтверждено, что различные составляющие, выделенные из пищевых и лекарственных растений, иногда могут быть антиканцерогенными и антимутагенными. В последние годы фенольные липиды привлекли внимание с целью потенциального использования в терапии и/или профилактике конкретных классов болезней. Фенольные липиды, в основном резорцинольные липиды, обладают способностью Cu2+-индуцированного разрезания ДНК. Параллельно они демонстрируют отсутствие мутагенного, канцерогенного и коканцерогенного эффектов и защищают ДНК от перекисного и УФ-индуцированного повреждения. Благодаря всем этим свойствам фенольные липиды интенсивно исследовались в качестве цитотоксических и противоопухолевых агентов.
Исследования биологической активности 5-пентадеценилрезорцинов, выделенных из Ginkgo biloba, показали их сильную противоопухолевую активность в отношении опухоли С180 у мышей. Активный компонент, 5-н-пентадека-8-енилрезорцин, вызывал почти полное ингибирование опухолевого роста клеток. Похожая активность наблюдалась для алкилрезорцина против клеток лейкемии P-338. Наличие карбоксильных групп в резорцинольном кольце не является обязательным для противоопухолевой активности, как обнаружено ранее для антибактериальной активности. Предварительная оценка потенциальных активностей 5-алк(ен)илрезорцинов, способствующих борьбе с опухолями, из масел отрубей Злаковых показала, что исследуемые соединения проявляют лишь умеренную активность против индукции ранних антигенов вируса Эпштейна-Барр, и было отмечено, что повышение длины цепи приводило к уменьшению активности, как было установлено для 5-н-алкилрезорцинов.
5-(2'-оксогептадецил)-резорцин и 5-(2'-оксононадецил)-резорцин, выделенные при брожении несовершенного базидиомицета, показывали цитотоксические эффекты в отношении опухолевых клеток толстой кишки человека линий COLO-320, DLD-1 и HT-29, человеческих промиелоидных клеток лейкоза линии HL-60, Т-клеточной лейкемии человека JURKAT, клеток человеческой гепатоцеллюлярной карциномы линии HEP-G2 и макрофагальной клеточной линии J774 мышей. Эти соединения вызывали морфологическую и физиологическую дифференциацию клеток HL-60 в гранулоциты, которые впоследствии умирали путем апоптоза. После 24 ч обработки 5-алкилрезорцином клеточные линии гепатоцеллюлярной карциномы показали типичные морфологические изменения от апоптоза, фрагментацию ДНК и уплотненные (конденсированное) и фрагментированные ядра. Цитотоксический эффект 5-алкилрезорцина на эти линии клеток не зависел от их р53 или Fas-фенотипического профиля.
Прямое взаимодействие резорцинольных липидов с белками было показано в экспериментах с мономолекулярными слоями этих соединений. Было также показано, что взаимодействие резорцинольных липидов с несколькими белками вызывало сильное подавление внутренней интенсивности флуоресценции остатков триптофана в белках, таких как эритроцитарный спектрин, белки фотосистем и трипсин.
Длинноцепочечные резорцинольные липиды вызывали уменьшение активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарной мембраны, одновременно стимулируя активность Ca2+-зависимой АТФазы. Ингибирование активности ацетилхолинэстеразы в гемолизированных эритроцитах наблюдалось также для других фенольных липидов. Ацетилхолинэстераза эритроцитов относится к истинным ацетилхолинэстеразам (ацетилхолинэстеразам 1-го типа), содержащимся в нервной и мышечной тканях, сердце, легких. К эритроцитам она прикреплена с внешней стороны и отвечает за транспорт ионов через цитоплазматическую мембрану. В других частях организма разрушает холин и холиноподобные соединения.
Модулирующие свойства 5-н-алк(ен)илрезорцинов на активность мембранных белков могут проистекать не только из их непосредственного взаимодействия с молекулой белка, но также и от изменений в их боковой подвижности и/или в способности взаимодействовать с поверхностью фосфолипидного бислоя. Это предположение подтверждается исследованиями влияния резорцинольных липидов на сродство фибриногена к его рецептору в мембранах тромбоцитов. Инкубирование клеток с микромолярными концентрациями различных гомологов алкилрезорцина вызывало значительное уменьшение сродства фибриногена к его рецептору. Исследования кинетики гидролиза фосфолипазы А2 поджелудочной железы в фосфатидилхолиновом бислое, модифицированном алкил(ен)резорциновыми гомологами, также предполагают такую же возможность. Было показано, что 5-н-алкилрезорциновые гомологи, включенные в липосомальные мембраны, вызывали резкое увеличение латентного этапа фермента.
Концентрации АОБ, не оказывающие повреждающего действия, одинаковы как для эритроцитов барана (ЭБ), так и для лимфоцитов крови человека. Наиболее выраженное цитотоксическое действие оказывал препарат С12, что, возможно, связано с его гидрофобными свойствами.
Под действием препарата С12 наблюдалось повышение уровня «активных» розеткообразующих колоний (РОК) на 62% при обработке ЭБ и на 57% при обработке лимфоцитов и снижение уровня «общих» РОК как при обработке ЭБ (на 30%), так и лимфоцитов (на 26%). С7 и С8 не изменяли уровень «общих» РОК при обработке ЭБ и снижали – при обработке лимфоцитов: С7 – на 39%, С8 – на 46%. Уровень «активных» РОК при действии С8 повышался при действии на ЭБ на 30% и не изменялся после обработки лимфоцитов. Следует подчеркнуть, что все изученные АОБ при действии на лимфоциты вызывали снижение «общих» Е-РОК. Возможно, их влияние связано с изменением рецепторной функции мононуклеаров в результате модификации мембранных структур клеток.
При изучении изменения адгезивных свойств иммунокомпетентных клеток под действием АОБ показано, что АОБ С7 вызывал увеличение адгезивной способности в 1.5 раза, а С8 и С12 способствовали снижению уровня адгезии.
Установлено подавление поглотительной и секреторной активностей нейтрофильных фагоцитов после их предварительной обработки химическими аналогами алкилоксибензолов (АОБ) микробного и растительного происхождения. Показано, что подобное действие высоких концентраций АОБ сопряжено с цитотоксическим эффектом, наиболее выраженным у их мембранотропных длинноцепочечных гомологов. Снижение действующих концентраций АОБ до значений, соответствующих их присутствию в крови и тканях человека, отменяет цитотоксичность, но сохраняет значения активации нейтрофилов ниже референтных. Выявление подобной гипоактивации фагоцитирующих клеток рассматривается в контексте модуляции иммунной системы при образовании АОБ компонентами микробиоценоза или их поступлении с зерновыми продуктами питания.
Сильная ингибирующая активность наблюдалась для фосфолипазы А2 кобры в присутствии смеси бактериальных алкилрезорцинов в лецитиновой черной липидной мембране и фосфолипидных эмульсионных системах. Наблюдалось почти полное ингибирование (95%) изучаемого фермента, что приводило к дефектам в фосфолипидной упаковке внутри бислоя.
Алкилоксибензолы способны стабилизировать ферменты в водной среде и повышают их каталитическую активность. Они имеют химическую функцию шаперонов как, например, лиганды, которые неспецифически взаимодействуют с молекулами биополимеров, меняют свою конформацию и повышают свою устойчивость к изменению естественных свойств факторов. С7 и С12-алкилоксибензолы влияли на степень набухания белка, вязкость и степень гидрофобности. Эффекты зависели от структуры этих соединений, их концентрации и рН раствора.
Было исследовано влияние химических аналогов ауторегуляторного фактора d1, относящиеся к классу алкилоксибензолов, С1-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ на активность сериновой протеиназы Baсilluspumilus 3-19. Показано ингибирующее действие этих соединений на активность внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus 3-19, cекретируемой на ранней стационарной фазе роста. С6-АОБ оказывает более выраженное ингибирующее действие на субтилизин, чем С1-АОБ, что, видимо, объясняется разной гидрофобностью этих веществ. Максимальный ингибирующий эффект С6-АОБ проявляет в больших концентрациях (10-2М).
Установлено, что химические аналоги бактериальных ауторегуляторных молекул из группы алкилоксибензолов при взаимодействии с антителами (АТ) способны изменять характер их взаимодействия с антигенами. Спектр регистрируемых эффектов включает блокирование связывания с гомологичным и перекрестно реагирующими антигенами, а также частичное изменение специфичности АТ с формированием возможности их взаимодействия с исходно не реагирующими гетерологичными антигенами.
Было проведено исследование Дерябиным Д. Г. и соавторами по влиянию алкилоксибензолов на компоненты систем «антиген-антитело» и «фермент-субстрат». Определено, что в ферментной системе «лизоцим –M. luteus» метилрезорцин во всем диапазоне использованных концентраций и вариантах постановки экспериментов вызывал увеличение скорости литической реакции. В свою очередь гексилрезорцин вызывал в ферментной литической системе противоположные дозозависимые ингибирующие эффекты, заключающиеся в снижении регистрируемых значений максимальной скорости.
В серии аналогичных экспериментов с использованием системы «антитело – антиген» характер действия алкилоксибензолов несколько отличался от описанного выше. При модификации антител в использованном диапазоне концентраций С1-АОБ зарегистрировано снижение показателей их связывания с соответствующими антигенами лишь на 7% от контрольных значений. В свою очередь предварительная инкубация антигенов с данным ауторегулятором несколько больше изменяла значения отражающей количество образовавшихся комплексов «антиген – антитело» оптической плотности, изменяющейся с увеличением действующих концентраций С1-АОБ. С6-АОБ оказывал на способность антител к специфическому взаимодействию с соответствующими антигенами значительно более выраженные эффекты. При этом результатом являлось существенное снижение параметров связывания с увеличением концентрации данного алкилоксибензола и в максимуме эффекта отклоняющихся от контрольных значений на 81%. С другой стороны, при инкубации антигенов с С6-АОБ показатели связывания менялись незначительно, что сопровождалось их достаточно слабым влиянием на параметры системы при одновременной обработке антител и антигенов.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Грязева И. В., Давыдова О. К. Роль алкилоксибензолов в регуляции стрессового ответа бактерий // Вестник ЧелГУ. 2013. №7 (298) С.55-57.
2. Давыдова O. K., Никиян А. Н., Дерябин Д. Г. Формирование упорядоченных надмолекулярных структур ДНК в водных растворах в присутствии алкилрезорцинов // Вестник ОГУ. 2005. №1 С.174-177.
3. Дерябин Д. Г., Романенко Н. А., Эль-регистан Г. И. Изменение специфичности антител в присутствии алкилоксибензолов — химических аналогов бактериальных ауторегуляторных молекул // Иммунология. 2013. №1 С.27-30.
4. Дерябин Д.Г., Михайленко Н.А., Кобзева Т.Г. Дисперсионный анализ эффектов алкилоксибензолов в системах «Фермент - субстрат» и «Антиген - антитело» // Вестник ОГУ. 2008. №12-1 С.143-147.
5. Евтюгин В. Г., Маргулис А. Б., Бушманова О. В., Никитина Е. В., Колпаков А. И., Дамшкалн Л. Г., Лозинский В. И., Ильинская О. Н. Гидрофобизованные производные широкопористого криогеля поливинилового спирта: новые возможности применения в биотехнологии // Вестник Казанского технологического университета. 2010. №9 С.89-96.
6. Казацкая Ж. А., Шаров М. А., Новиков В. В., Эль-регистан Г. И. Влияние алкилоксибензолов на функциональную активность клеток крови in vitro // Вестник ННГУ. 2012. №2-3 С.191-195.
7. Короткова А. М., Давыдова О. К. Эффекты синтетических алкилрезорцинов на топологические изменения ДНК, опосредованные активными формами кислорода, в системе in vitro // Вестник ОГУ. 2015. №6 (181) С.157-164.
8. Маргулис А. Б., Яруллина Д. Р., Колпаков А. И., Ильинская О. Н. Роль внутриклеточных No и АФК в ответе лактобацилл на сигнальные молекулы бактерий - гомосеринлактон и гексилрезорцин // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. 2010. №2 С.137-144.
9. Свиридова Т. Г., Слободчикова С. В., Дерябин Д. Г., Шмагель К. В., Черешнев В. А. Влияние алкилоксибензолов на поглотительную и секреторную функции нейтрофилов периферической крови человека // Иммунология. 2013. №2 С.84-88.
10. Смоленцева О. А., Яруллина Д. Р., Ильинская О. Н. Индукция синтеза NO у лактобацилл в условиях стресса // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. №1 С.25-29.
11. Шайдуллина Э.Р., Рудакова Н.Л., Михайлова Е.О., Шарипова М.Р., Марданова А.М. Влияние алкилоксибензолов на активность субтилизина Bacilluspumilus 3-19 // Вестник Казанского технологического университета. 2014. №22 С.235-237.
12. Stasiuk M., Kozubek A. Biological activity of phenolic lipids. Cell. Mol. Life Sci. (2010) 67:841–860.